СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ О-РИБУЛОЗО-1,5-ДИФОСФАТА Советский патент 1971 года по МПК C12P19/44 

О-рибулозо-1,5 - дифосфат (C5Hi2OiiP2) соединение, являющееся акцеитором углекислоты в уникальной реакции фиксации ее в нроцессах первичного биосинтеза органического вещества на нащей планете - фотосинтеза и хемосинтеза. Фермент, ответственный за эту реакцию, - рибулозодифосфаткарбоксилаза - изучен очень мало. Наличие достаточного количества В-рибулозо-1,5-дифосфата - необходимое условие для выяснения механизма этой важнейщей ферментативной реакции карбоксилирования.

Принцип получения О-рибулозо-1,5-дифосфата основан на ферментативном превращеНИИ исходного продукта В-рибозо-5-фосфат в О-рибулозо-1,5-дифосфат, протекающем в две стадии с участием ферментов рибозофосфатизомерами (D - рибозо-5-фосфат-кетол-изомераза, индекс по номенклатуре ферментов 1966 г. 5.3.1.6) и фосфорибулокиназы (АТФ: О-рибулозо-5-фосфат-1-фосфат-трано - фераза, индекс 2.7.1.19).

Схема реакции состоит в следующем:

I.О-рнбозо-5-фосфат + рнбозофосфатизомераза О-рибулозо-б-фосфат.

II.О-рибулозо-5-фосфат + АТФ + фосфорибулокиназа D - рибулозо - 1,5 - дифосфат+АДФ.

0-рибулозо-1,5-днфосфата состоит из четыре.х основных стадий.

1)Получение ферментного препарата рибозофосфатизомеразы из листьев шпината.

2)Получение ферментного препарата фосфорибулокиназы также из листьев шпината.

3)Образование О-рнбулозо-1,5-дпфосфата ферментативным путем из рпбозо-5-фосфата и АТФ.

4)Выделение препарата О-рибулозо-1,5-д 1фосфата в внде бариевой соли и его очистка.

Первые две стадии, если даже они объединены, весьма трудоемкн и ненадежны. Это связано с тем, что участвующие в синтезе О-рибулозо-1,5 - дифосфата ферментные препараты рибозофосфатизомеразы и фосфорибулокиназы но различным нричинам часто бывают недостаточно активны или содержат иежелательные ирпмеси. Ферменты рнбозофосфатизомераза и фосфорпбулокипаза, локализова111 ые в хлоронластах, находятся в слабощелочной среде. Клеточный сок листьев большинства видов растений имеет явно кислую реакцию и часто содержит различные ингибиторы, что неблагоприятно отражается па активности фер.ментов при их выделении из хлоронластов. Сравнительно редкое исключение представляют лнстья шнината, у которых реакция клеточного сока блнзка к нейтральной. Однако активность рпбозофосфатнзомеразы и фосфорибулокииазы, очевидно, зависит от физиологического состояния листьев вследствие чего попытки получения ферментов не всегда успешны.

В отличие от известных способов предлагается в качестве ферментного препарата для получения О-рнбулозо-1,5-дифосфата из рибозо-5-фосфата и аденозинтрифосфата (АТФ) использовать неочищенный бесклеточный экстракт тионовых бактерий Thiobacillus 58 R (штамм выделен в Институте микробиологии АН СССР).

Эти бактерии обладают рядом свойств, использование которых дает большие преимуш,ества. Тионовые бактерии Thiobacillus 58 R неприхотливы, растут достаточно быстро, не требуя ни дорогостояш,их реактивов, ни сложного оборудования.

Разработан следующий способ получения бариевой соли О-рибулозо-1,5 дифосфата.

Микроорганизмы выращивали в лабораторных условиях на минеральной среде состава:

NasSaOa5 г

СаНР045 г

КН2РО43 г

MgCla100 мг

NH4C1100 лгг

на 1 л водопроводной воды с непрерывной аэрацией (Emoto, 1929, Ргос. Ттр. Acad. Tokio, V, 5). Урожай сырой биомассы с 5 л среды от 1 до 2 г. Разрушали клетки для получения бесклеточного экстракта озвучиванием суспензий микробов в десятикратном количестве 0,05 моль трис-С1-буфера рН 7,5 (триогидрокси) метиламинометан, нейтрализованный соляной кислотой) при 0°С в аппарате MSE мош:ностью 500 в при 20 килоциклах, в течение 10 мин. Экстракт отделяли центрифугированием при 15 000 g в течение 30 мин.

При составлении ферментной смеси для превращения рибозо-5-фосфата в D-рибулозо1,5-дифосфат была принята за основу методика, предложенная для определения фосфорибулокиназы (J. Hurwitz, Methods in Enzymology т. 5, стр. 258), MgCb6H2O- 2000 ммоль. Навеску 406,7 мг растворяли в 5 мл воды, перегнанной из стекла.

Цистеин солянокислый - 500 ммоль. Навеску 78,8 мг растворяли в 2 мл воды и нейтрализовали сухим трис-буфером до рН 7,5.

Рибозо-5-фосфат бария переводили в натриевую соль. Для этого 2000 ммоль рибозо-5фосфата бария (навеска 840 мг с учетом содерл ания в препарате 15% гигроскопической воды) растворяли в 10 мл охлажденной до 0°С 0,1 н. соляной кислоты и добавляли 2000 ммоль (284 мг безводной соли) сульфата натрия. Осадок BaSO4 удаляли центри(|)угированием, а супернатант нейтрализовали до рН 7,5 добавлением сухого трис-буфера.

рН 7,5 добавлением сухого трис-бул и до фера.

Проведение реакции иолучения D-рнбуло30-1,5-дифосфата.

К 30 мл ферментного препарата добавляли 2 мл раствора цистеина, 5 мл раствора хлористого магния, 10 мл раствора рибозо-5фосфата натрия и 10 мл раствора АТФ. Конечный объем смеси около 60 мл.

Реакцию проводили в атмосфере аргона, который может быть заменен другим инертным газом, не содержащим углекислый газ, при комнатной температуре с подтитровкой 1 и. раствором NaOH для поддержания рН ферментной смеси 7,5-7,8. Реакция продолжалась от 3 до 5 мин. Затем ферментную смесь охлаждали до 4°С, белок осаждали 5%-ной трихлоруксусной кислотой (конечная концентрация) и осадок удаляли центрифугированием.

Очистка и выделение О-рибулозо-1,5-дифосфата бария.

В основу дальнейшей процедуры частичной очистки и выделения бариевой соли иоложена методика Хореккера и сотр (Horecker В. Z. et al. Methods in Enzymology, 1957, т. 3, стр. 193, с некоторыми модификациями). Для удаления нуклеотидов (АТФ н АДФ) полученный раствор обрабатывали 60 г активированного угля марки БАУ, предварительно промытого 1 н. ПС1 и затем 10% ТХУ и отмытого водой до нейтральной реакции. Ж1дку о фазу отделяли от угля фильтрованиел на Бюхнеровской воронке с отсасыванием, уголь многократно (4-5 раз) промывали водой но 100 мл, каждый раз суспендируя уголь в воде. Опытный раствор и промывные воды объединяли и нейтрализовали до рН 6,0 осторожным добавлением NaHCOs.

Затем к раствору добавляли 2 мл 1 н. уксуснокислого бария и бариевую соль D-рибулозо-1,5-дифосфата осаждали добавле)1ием 96%-ного этанола до конечной конпентрацин 30 об. %. Осадок пр0 мывалио 80%-11ым этаполом и высушивали до постоянного веса в вакумме эксикаторе над Р205.

Полученный продукт весил 300 .мг, что соответствует выходу 25% от теоретического.

Препарат В-рибулозо-1,5-дифосфата весьма гигроскопичен. Он нолучается в виде дибариевой соли, склонной к присоединению кристаллизациоиной воды.

Анализ нолученного пренарата на содержание фосфора (в %) представлен в табл. 1.

Таблица 1

Фосфор 0-рнбулозо-1,5-дифосфата определяли по количеству щелочслабплыюго фосфора.

Эле.меитарпып анализ показал соответствие формуле

СзНвОцРгВаг-УНгО.

Экспериментальные данные, %: С 8,60; 8,69; II 2,81; 3,09; Р 8,8,13; 7,72.

Рассчетпые данные, %: С 8,49; Н 3,10; Р 8,79.

В табл. 2 дапа ферментная активность препарата.

Таблица 2

фата составляют стоп.мость реактпвов п онлата труда.

Расходы па одно получеппе (300 мг) препарата О-рпбулозо-1,5-дпфосфата приведены в табл. 3.

Т а б л II ц а 3