Способ получения -рибулозо-1,5дифосфата Советский патент 1979 года по МПК A61K38/43 

Изобретение относится к получению oj ганичесжих биологически активных веществ с помощью иммобилизованных ферментов. Б Рибупозо«-1,5« ифосфат занимает ценгральное место в биосинтезе органичес- кйх веществ во всех зеленых растениях : н в ряде микроорганизмов, являясь акцептором углекислоты в цикле Кальвина, Соответствующую реакцию катализует фермент рибулозо-дифосфаг карбоксрлаза (КФ 4.1.1.39). Предпосылкой всестороннего иэуче1а ия мв анизма действия этого фер- НА «О I Нй-ОЙ не- он J I о HiC-o-p- о Д- fuSne-S - фвс9ат .€«0 Яле-о Д PaSy ffffC менга является наличие достаточного количества Ti -рибулозо-1,5-дифосфата. Получение Т)-рибулозо 1,5-дифосфата основывается на ферментативном превращении D - ибозо-5-фосфата в Б-рибулозо-1,5-дифосфат. Реакция протекает в две Ьтадии с участием ферментов рибозофосфатизомеразы (Б-рибозо-5-фосфат-кетол- -изомераза КФ 5.3.1.6) и фосфорибулаки назы (АТФ:Д-рибулозо-5-ф6сфат« 1-фосфат трансфераза КФ 2.7.1.19) по следующей схеме . . I HjC-o-p I НС-он I локиназл не- он -о- О - Р - 0 Г A-PU 5 -5- вифосфат Известен способ получения D -рибуло« зо--1,5-дифосфага, имеюший промышленное значение l. По этому способу целевой продукт получают ферментативно из В -рибоао-5-фосфата и аденозин- -трифос 4«та {АТФ) с применением в качестве биркатализатора бесклеточного экстракта тионовых бактерий ThioboiciEEtis S&R , По йучение целевого продукта по этому спосо бу предусматривает проведение трех ос- новных стадий: получение ферментных препаратов рибо- зофосфатизомеразы и фосфорибулокиназы; синтез Э -рибулозо-1,5-дифосфата фер ментным путем из D -.рибозо-б-фосфата и АТФ в атмосфере инертного газа, предпочтительно при рН 7,5-7,8} выделение препарата Б -рибулозо-1,5- -дифосфата обычно в виде бариевой соли и его.очистка. Недостатком этого способа является применение в качестве ферментного катализатора водорастворимого бесклеточного экстракта тионовых бактерий. Водораство- ри;мый бесклеточный экстракт тионовых бактерий можно применять только однокра но, .В ходе вьщеления и очистки D -рибу- л6зо-1,5- дифрсфата из реакционной смеси ферменты бесклёточного экстракта инакти вируются необратимо. В то же время выращйвание бактерий и выделение бёсклеточного экстракта являются наиболее трудоемкими этапами получении О -риб гтлозо-1«5-дифосфага. Целью изобретения ЯБЛяе1 ;я упрощение способа получения ТЗ-рибулозо-1,5-йи фосфата и пов ышение выхода целевого продукта. - . ,. . : . . - . Указанная цель достигается тем, что белки бесклеточного экстракт связывают на пористой стекле, активированием фос- .геном и полученньШ иммобилизованный ферментный препарат используется много- .кратно.. Согласно изобретению описывается спо соб получения В -рибулозо-1,5-иифосфа,га путем взаимодействия 13 -рибозо-5- -фосфата и АТФ в атмосфере инертного газа с использованием в качестве биокатализатора бесклеточного экстракта штамма ТЫ о bacitE us 581 (Институт микробиопогин АН СССР), иммобилизованного на пористом стекле, активированном фоогеном. Процесс обычно проводят в атмосфере аргона при рН среды 8,4-8,6. Применяемый катализатор можно ио- пользовать многократно. Предпочтительно процесс проводят слб- дуюшим образом. Исходное сырье: получают иммобилизованные экстракты тионовых бактерий посредством связывания их с пористым стеклом, активированным при помощи последовательной обработки - -аминопропилтриэтоксисиланом и фосгеном {изоцианатное стекло). Белки бесклеточного экстракта (Ю мг/мл) связывают с активированным изоцианатными группами стеклом (0,5г/мл) в 0,1 М фосфатном буфере (рН 7,6-7,8) в течение 15-20 ч на холоду. Препарат отмывают от несвязанных белков iMpacT вором NaCt. Целевой продукт готовят следующим образом. Готовят реакционную смесь, содержащую следующие компоненты (указаны конечные концентрации), ммоль: MgCE. 27; цистеин 6,6; D-рибозо-5-фосфат 27; АТФ 27. рН раствора доводят до 8,4 8,6 с помощью 2 н. КаОН, Прибавляют It смеси иммобилизованный ферментный: препарат (33 г на 1 л). Реакцию проводят в атмосфере аргона, отсутствие:угпекислого газа в системе 5голяется необходимым условием, при коь1натной темпера- .туре, рН раствора поддерживают при 8,48,6 титрованием 2,0 н. раствором NaOH. Тродолжительнорть реакции 2-3 ч. ЖийKyip фазу бтделя1бт п6средст1вом декантиров ния. Стекло отмьшают водой. Основной раствор и иромывньш воды объединяют, затем проводят частичную очистку целе вого продукта и выделяют обычно в виде бариевой сойи иэвеетньп методом. ТехНйко-экономическая эффективность oi йсйоЯЬзованйя предлагаемо1х способа для получения D рибулозс -1,5-диф6сфата выражается в обеспечении по сравне- рий с сущест1вующими сяо 6бами следук. щйх преийуЩеётв: .в связи с многократ HbiM применением биокатали тора уменьшаются расходы на выратцйвание микроорганизмов и выделение ферментного препарата, применение твердого биокатализа- тора по оляёт увеличить выход IJ - ибулозо-1,3 йнгфся::фата-в 1,8 раз по сравне ВИЮ с растворимым ферментным п|эепаратомП р и м е р. Исходное сырье: 10 г пористого стекла о6рабать1вают в течение 30 ч 5%.ым раствором -аминопропи этриэтоксисилйвд в абсолютном толуоле (1ОО мл) при темпе ратуре кипения раст вора. После охлаждения стеклопромыва ют толуолЬм и обрабатьгоают в течение 2 ч 0,25 М раствором фосгена в абсолкугном толуоле (20 мл) при гемперагуре ки пения толуола. В ходе обработки аминогруппы на поверхности стекла переходят в изоцианатные. Полученное изоцианатное стекло высушивают в вакууме при темпеpa туре ниже 100 С. Клетки тионовых бактерий ThiofeacttCus 58R (штамм выделен в Институте микробиологии АН СССР) разрушают озвучиванием суспензии микробов в десятикратном количестве 0,i М фосфатного буфера (рН 7,6) при в аппарате УЗДН-1 У 4.2 при ч&сгоке 22 кГц в теч&ние Ю мин Оболочки клеток осаждают центрифугирова нием при 2ОООО в течение 40 мин. Связывание белков бесклеточнЬшэйр тракта тионовых бактерий проводят в ОД М фосфатном буфере (рН 7,6-7,8)7 10 г активированйохх изоцианатными группами стекла суспендируют в 20 мл раствора, содержащего 10 мг белка el мл. Полученную суспензию вакуумируют для удаления воздуха из пор стекла и ос тавляют в холодильнике (4С) на 15 «« 20 ч при постоянном иеремешиванйй. По- лученный препарат промывают 1 л 1,ОМ pacJBopa N аСЕ в колонке в течейие 3 ч -И хранят в холодильнике ()вОД5 М растеора КаСЬ, При составлении реакциошюй смеси для превращения Ц -)Ри6оЗо 5-фосфазга в 1) рибулозо-.1,5-йифосфат за основу 61лш принята методика, предложенная для ostipe деленй я рибулокиназы; Н-О (8 ммоль) - навеску 1,63 г рас1«о{}яют в 20 мл воды. Цистеин солянокислый (2 ммойь) - навеску 0,355 г растворяют в 10 мл воды, рйбозо-5-фосфат рпя щереводят В нйт)риевую соль. Для этого |8 м:Моль;-риб6зо-5-фосфата (навеска 3,36 г с учетом содержания в препаг -рате i5i% воды) растворяют в 40 йл ох« (Лажденнрй до ОД н. соляной KHcrio-i те и добавляют 8 ммоль (1,136 г безвод ной соли) сульфата натрия. Осадок BaSQ4 удаляет «ентрифугирСванием. Аденоз1ш-5 -трифосфорная кислота, наТ риевая сойь (АТФ) - 8 ммоль{ навеску 5,О7 г растворяют в ЗО кстводы.. В четьфехгорлую ко;йу емкостью 50О мл, снабженную механической мешалкой, электродами рН-стата и трубками для введения газа н титрующего раствору заливают 15О мл бидистиллированной во ды, 20 мл раствора хлористого магййя, 1О мл растеора цистеина, 4О мл jpacieopa рибозо-5-фосфата натрия и 30 мл рает вора АТФ. Добавлением 2,О н. раствора hTaOil при интенсивном перемешивании поводят pf{ раствора до 8,4-8,6. Прибавляют 10 г ферментного препарата и воды до общего объема ЗОО м.л. Реакцию проводят в атмосфере аргона при комнатной температуре, рН раствора поддерживают при 8,4-8,6 титрованием 2,0 в. раствором N аОН. Продолжительность реакции 2-3 ч. Жидкую фазу реакционной смеси отделяют от стекла декантированием. Стекло промывают двумя порциями воды по 15мл, Основной раствор и промывные воды обье диняют и наносят на колонку (3,0x30 см) с сильноосновным анионитом JBowex-M в СЕ-форме со скоростью 100 мл/ч. Адсорбированные веществй элюируют линейным градиентом соли и кислоты, составленным из 2,0 л бидистиллированной водыи2,0 п 6,3 М КаСС + 0,ОЗ М нее при скороог ти 1ОО мл/ч. В -Рибулоэо-1,5-дифосфат вьЕсодиТ из колонки сразу после АТФ. Разделение является неполным, фракции, содержащие В -рибулозо-1,5-дифосфат, объединяют, доводят рН раствора до 2,0 прибавлением 2,0 н. раствора НС. Прибавляют 15,0 г активированного медицин- ского угля, п|эедварительно промытого в колонке 1 н. НС, а затем 1О%-ноЙ трихлоруксусной кислотой, и отмьгтого до нейтральной реакции.. Жидкую фазу отделйют от фильтрованием, угопъ много ipaTHO (4-5 раз) промывают водой до 20 мл, каждый раз суспендируя уголь в воде. Промьгеныё воды объединяют с осHOBHbiM раствором и доводят до рН 6,0 добавлением растеора МаОН. Затем к раствору добавлшот 15 мл 1,0 М j cTBOpa уксуснокислого бария н бариевук) соль В -рибулозо-1,5-дифосфата осфвдают добавлением 96%.ч1ого этанола до конйентрадии 30% (по объему). Осадок отдепяк)Т дёнтрифугирснванием, про мывают 8О%««ым этанолом и высушива- ., .,, т до постоянного веса в вакууме над Вес подученного продукта (2,95 г) оогвётс;Твует выходу 5О% от теорети еского. Анализ препарата на содер)йанив шелоч олабильного фосфора показьтает, что пре арат содержит 75% D -рибулЬзо -1,5 йифосфата. Проверку способности препарата акцепировать углекислоту проводят с 14С«ме« енным бикарбонатом натрия в щзнсутст-ни гомогената ЕЛГСШИХ растений. Рвзуль

,. 667558

. ,, Q

tarbi ЬпрёДеления радиоакгивносги свиде в качестве биокагализатора применяют

tenbCTByiot о высоком качестве получен-бесклеточньтй экстракт штамма Thiobacittus

него препарата как реактива-акцептора58R {Институт микробиологии АН СССР),

С0„.иммобилизованный на пористом стекле, акФорму.ла изобретения2. Способ по п. 1. о т л и ч а ю 1. Способ получения D -фибулозо« 1,5«-щи и с я тем, что процесс ведут при

-дифосфаГа путем взаимодействия ТЗ-ри-рН 8,,в в атмосфере аргона. / бозр-5-фосфата и аденозинтрифосфата ватмосфере инертнохч) га:за с использовани-10 Источники информации, принятые во

ем бибкаталйзат-ора, о т л и ч а к ш и и внШаяйв 1фн экспертизе с я тем, чго, с йелью упрощения процес 1. АвторскЬе свидетельство СССР

са и повышения выхода целевого продукта, 1 3б9610,кл,С12 1)13/16,30.11.71.

5тивированном фосгеном.