Способ получения глюкуронидазы Советский патент 1980 года по МПК A61K37/00 

1

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности, а именно к способам получения ферментных препаратов, используемых в биохимических и медицинских исследованиях.

Известен способ получения / -глюкуронидазы из экстракта измельченной печени фракционированием в ацетатном буфере рН 5,0, аутолизом при 38°С в течение 8- 10 ч, отделением осадка центрифугированием, обработкой ацетатным буфером, добавлением сульфата аммония и выделением целевого продукта в смеси ацетон-вода в соотношении 1:2 1.

Однако известный способ не обеспечивает получения препарата с высокой активностью (активность препарата 100000-120000 ед/г).

Целью изобретения является повышение активности препарата.

Это достигается тем, что по предлагаемому способу экстракт обрабатывают водой, центрифугируют, осадок обрабатывают водой, раствор диализуют и лиофилизируют.

Пример 1. Свежую печень измельчают на мясорубке. В реактор с мешалкой загружают 10 кг фарша и смешивают с 7,5 литрами 0,2 М ацетатного буфера рН 5,0. Смесь

выливают в кастрюлю и выдерживают 20 ч в термостате при 37°С. Осадок отделяют центрифугированием на «Mistral при 2500 об/мин в течение 30 мин при 15-20°С. Фермент содержится в центрифугате. Осадок 5 промывают 3,5 л 0,2 М ацетатного буфера рН 5,0, снова центрифугируют при 2500 об/мин, 30 мин при 15-20°С. Экстракты соединяют. Общий объем центрифугата около 18 литров. Осадок выбрасывают.

К 18 л экстракта при перемешивании

10 добавляют 6 кг сухого сульфата аммония из расчета 0,334 кг на 1 л экстракта при 15-20°С.- Перемешивание продолжают еш,е 30 мин до полного растворения сульфата аммония. Раствор выдерживают 12 ч при О-4°С без перемешивания. Выпавший осадок отделяют центрифугированием при 2500 об/мин 30 мин, тепмпература О-4°С. Центрифугат отбрасывают. Осадок промывают 5 л 23,2%-ного раствора сернокислого аммония, охлажденного до О-4°С и центри20 фугируют при 2500 об/мин в течение 30 мин при О-4°С.

Промытый осадок растворяют в 2 л деминерализованной воды и для лучшего растворения суспензию выдерживают в термостате при 37°С 2 ч. Нерастворившиеся примеси отделяют центрифугированием при 2500 об/мин в течение 40 мин при 10-20°С. К раствору -глюкуронидазы около 2,2 л при постоянном перемешивании прибавляют 1 кг (350 г/л) сульфата аммония и оставляют на 12 ч при О-4°С. Выпавший осадок отделяют центрифугированием при 2500 об/мин и 4°С в течение 40 мин. Фильтрат отбрасывают. Осадок растворяют в 1 л воды и центрифугируют. Центрифугат диализуют в течение 4 сут и лиофильно высушивают. Выделенный препарат имеет активность 312000 е/г.

Выход - 60 г.

Осадок после последнего центрифугирования растворяют в 0,5 л воды и отделяют примеси центрифугированием. Центрифугат диализуют в течение 2 сут и лиофильно высушивают.

Активность - 192000 е/г.

Выход - 30 г.

Пример 2. 8 кг печени гомогенизируют с 6 л 0,2 М ацетатного буфера рН 5,0 и гомогенат оставляют на автолиз в течение 20 ч при 37°С. Автолизат центрифугируют. Осадок промывают ацетатным буфером рН 5,0 и центрифугируют. Центрифугаты объединяют 16 л.

К 16 л экстракта прибавляют сульфат аммония из расчета 0,334 кг на1 л экстракта и через 12 ч выпавший осадок отделяют центрифугированием. Осадок промывают 4 л 23,2%-ного раствора сернокислого аммония и центрифугируют. Центрифугаты отбрасывают.

Осадок, содержащий фермент ;б-глюкуронидазы, растворяют в 0,9 л дистиллированной воды и центрифугируют. Центрифугат и осадок обрабатывают отдельно. Водный

раствор диализуют в течение 5 сут и лиофильно высушивают. Активность выделенного препарата 320000 е/г.

Выход - 50 г.

Осадок после центрифугирования растворяют в 0,7 л воды и центрифугируют. Полученный раствор диализуют и лиофильно высушивают.

Активность выделенного препарата 100000 е/г.

Выход 30 г.

Предлагаемый способ обеспечивает улучшение качества ферментного препарата / -глюкуронидазы, который широко используется в медицинских и биохимических исследованиях. Очистка препарата от примесей предотвращает инактивацию и обеспечивает повышение активности и чистоты /5-глюкуронидазы в 3-5 раз. Использование такого препарата не требует присутствия активатора - ДНК. Исключение ацетона создает безопасность условия труда.

Формула изобретения

Способ получения /5-глюкуронидазы путем экстрагирования измельченной печени, выдерживания в ацетатном буфере, отделения осадка, обработки его ацетатным буфером и высаливания сернокислым аммонием, отличающийся тем, что, с целью повышения активности, экстракт обрабатывают водой,

30центрифугируют, осадок обрабатывают водой, раствор диализуют и лиофилизируют.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1. Крехова М. А. Проблемы эндокринологии и гормонотерапии. 1960, т. 6, № 2,

31с. 55-63.