Способ получения ферментов Советский патент 1985 года по МПК A61K38/44 

со

Изобретение относится к энзимологии и может быть использовано для получения ферментных препаратов, которые находят нжрокое применение в качестве химических реагентов в биохимической практике, в технологии лекарственных веществ, а также для энзимодиагностики и энзимотерапии.

Цель изобретения - одновременное получение альдолазы глицерофосфатдегидрогеназы и глицеральдегидрофосфатдегидрогеназы.

Пример I. I. Мышцы кролика, взятые сразу после обескровливания, хорошо охлаждают на льду, освобождают от жировой, соединительной тканей и измельчают на мясорубке.

II.Экстрагирование. Измельченные мышцы в количестве 500 г смешивают с двукратным количеством 0,03 М раствора однозамеп1енного фосфорнокислого калия (рН 8,1), содержаш.им ЭДТА (500 мг/мл), и оставляют при О-4°С на 30--40 мин при частом перемешивании: Затем экстракт отделяют от твердых частей путем фильтрации через марлю под давлением.

III.Фракционирование сульфатом аммония. К полученному экстракту добавляют насьицеппый раствор сульфата аммония до концентрации 32,4% насыщения от объема в течение 40-60 мин при О-4°С. Насыщенный раствор сульфата аммония добавляют небольшими порциями. Образовавшийся осадок балластных белков отбрасывают центрифугированием при 2000-2500 g в течение 15-20 мин при О-4°С.

К цептрифугату добавляют насыщенный раствор сульфата аммония до концентрации 39,6%. Центрифугируют при 2500-4500 g в течение 7-10 .мин.

V. Стабилизация и кристаллизация альдолазы. Осадок, содержащий значительное количество альдолазы, растворяют в 5 мл 0,03 М раствора однозамещенного фосфорнокислого калия, содержащего ЭДТА в концентрации 500 мг/л, при , рН раствора 6,4-6,6; добавляют 3 мл насыпхенного раствора сульфата аммония (рН 7,5-7,6). Кристаллизация альдолазы протекает в 3,2 М растворе сульфата аммония в течение 3-4 дп. при О-4°С.

Перекристаллизация альдолазы. Первичные кристаллы собирают центрифугированием при 3500-5000 g в течение 5-7 мин. Растворяют в 2 мл о.хлажденной бидистиллиронанной.воды или в охлажденном 0,ОЗМ растворе однозамещенного фосфорнокислого калия. Добавляют 3 мл насьицеппого раствора сульфата аммония рН 6,2-6,4.

Выход 150 мг из 0,5 мг мыпщ. Активность не менее 15,5 Е/мг белка.

Сохраняют препарат в виде суспензии в 3,2 М растворе сульфата аммония в течение 812 мес при 0--4°С.

V. Получение глицерофосфатдегидрогепазы.

Кристаллизация. После центрифугирования и отделения альдолазы в надосадочной .жидкости (IV этап) при 20°С через 10-12ч при рН 6,2-6,4 кристаллизуется глицерофос5 фатдегидрогеназа.

Перекристаллизация. Кристаллы глицерофосфатдегидрогеназы отделяют центрифугированием при 3500-5000 g в течение 5-7 мин. Растворяют их в 2,0-2,5 мл холодной бидистиллированной воды. Добавляют насыщенный раствор сульфата а.ммония (рН 6,0-6,2) в количестве 3 мл. Рекристаллизация протекает при О-4°С и заканчивается спустя 2-3 дн.

Препарат глицерофосфатдегидрогеназы 5 сохраняется в виде суспензии в 3,2 М растворе сульфата аммония в течение 8-12 мес при О-4°С без существенных потерь активности.

Выход 51 мг из 0,5 кг мышц. Активность 10 Е/мг белка.

0 VI. Получение глицеральдегидрофосфатдегидрогеказы.

Центрифугат noCvie отделения осадка, содержащего альдолазу и глицерофосфатдегидрогеназу (этап III), насыщают до 48,9°/о 5 добавлением насыщенного раствора сульфата аммония, рН 5,6-5,9. Образовавщийся осадок фильтруют через складчатый бумажный фильтр.

Кристаллизация дегидрогеназы фосфоглицеринового альдегида протекает при 20°С в 0 фильтрате. Начинается через 8-10 ч и завершается через 2-3 дн.

Перекристаллизация. Первичные кристаллы отделяют центрифугированием при 3500-5000 g в течение 5-7 мин. Осадок растворяют в 3-4 мл охлажденной биднстиллированной воды и добавляют равный объем насыщенного раствора сульфата аммония, рН 5,7-5,8.

Рекристаллизация происходит при О-4С, завершается через 2-3 дн. Хранение глицеральдегидрофосфатдегидрогеназьЕ осуществляют в суспензии 2.2 М раствора сульфата аммония при О-4°С в течение 12-24 мес. без существенных потерь активности фермента.

Выход 200,5 мг из 0,5 мг мыщц. Актив5 ность 18,6 Е/мг белка.

Пример 2. . Подготовку сырья проводят аналогично примеру 1.

II.Экстрагирование. Измельченные мыщцы в количестве 500 г смешивают с лвуQ кратным количеством 0,032 .V раствора однозамещепного фосфорнокислого калия рН 8,2, содержапдим ЭДТ.Л (500 мг/л), и оставляют при на 30-40 мин при частом перемешивании. Затем экстракт отделяют от твердых частей путем фильтрации че5 рез марлю под давлением.

III.Фракционирование сульфатом аммония. К по/1учепному экстракту добавляют насып1енный раствор сульфата аммония до

32,6% насыщения от объема в течение 40- 60 мин при О-4°С. Далее так же, как в примере 1.

К центрифугату добавляют насыщенный раствор сульфата аммония до 39,8% насыщения. Центрифугируют при 2500-4500 g в течение 7-10 мин.

IV-VI этапы. Стабилизация и кристаллизация альдолазы и получение ГФД и ГАФД проводятся аналогично примеру 1.

Выход альдолазы 152 мг из 0,5 кг мыщц.Активность альдолазы 17 Е/мг белка.

Выход ГФД 52 мг из 0,5 кг мыщц. Активность ГФД 10 Е/мг белка.

Выход ГАФД 200 мг из 0,5 кг мыщц. Активность ГАФД 20 Е/мг белка.

пример 3. I. Подготовку сырья проводят аналогично примеру 1.

II. Экстрагирование. Измельченные мышцы в количестве 500 г смещивают с двукратным количеством 0,035М раствора однозамещенного фосфорнокислого калия рН 8,3,

содержащим ЭДТА (500 мг/л), и оставляют при О-4°С на 30-40 мин при частом перемещивании. Затем экстракт отделяют от твердых частей путем фильтрации через марлю под давлением.

III. Фракционирование сульфатом аммония. К полученному экстракту добавляют насыщенный раствор сульфата аммония до 33% насыщения от объема в течение 40- 60 мин при О-4°С.

К центрифугату добавляют насыщенный раствор сульфата аммония до 40%. Центрифугируют при 2500-4500 g в течение 7- 10 мин.

IV-VI этапы проводят аналогично при РУ 1Выход альдолазы 151 мг из 0,5 мг мыщц.

Активность альдолазы 15 Е/мг белка.

Выход ГФД 50,5 мг из 0,5 кг мыщц. Активность ГФД 10 Е/мг белка.

Выход ГАФД 201 мг из 0,5 кг мыщц. Активность ГАФД 20 Е/мг белка.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФЕРМЕНТОВ, включаюа1ий экстрагирование скелетной мышцы кролика, обработку полученного экстракта сульфатом аммония с последующими выделением и очисткой целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью одновременного получения альдолазы глицерофосфатдегидрогеназы и глицеральдегидрофосфатдегидрогеназы, экстракцию ферментов проводят 0,03-0,035 М раствором однозамещенного фосфорнокислого калия при рН 8,1-8,3, а обработку экстракта сульфатом аммония проводят при насыщении до 32,4-33%, после чего осадок отделяют и к супернатанту добавляют сульфат аммония до 39,6-40°/о, образовавшийся осадок, содержаший альдолазу и глицерофосфатдегидрогеназу, отделяют, а супернатант обрабатывают сульфатом аммония до 48,9- i 49°/о и вь1деляют глицеральдегидрофосфатдегидрогепазу. (Л