СПОСОБ ВЬЩЕЛЕНИЯ ФЕРМЕНТОВПРОТЕОЛИТИЧЕСКИХ Советский патент 1974 года по МПК C12N9/48 

1

Изобретение относится к ферментной промышленности, в частности к способам выделения ферментов из икробиологического сырья, а именно из мицелия ппесневых грибов.

Известны способы выделения протеолитических ферментов |из мицелия ппесвевьлх грибе или из культуральной жидкости, полученной при культивировании плесневых грибов, таких как

AspergfiEKus niQ-er, AspergiKEus огугае , AspergLtlus awamort Xlparg-ieEus fla.vus , AspergrUlus fumlg-atus. AsperffiEEuS QuVeu5 , Asperg-ttlus saCtol , Alpbrg teeu&terrctota .1

Целью изобретения является расширение сырьевой базы для получения протеолитических ферментов.

Для достижения поставленной цели выделение -ферментов осуществляют взм щепия грибов вида sperg-i fus terreuS , полученного при производстве итаконовой кислоты

Целесообразно экстракцию фермента осуществляют буферным раствором при рН 4,О- rtiCi и reb.jnenaTvpe О-в .

Способ выделения ферментов заключает ся в следующем.

Отделенный от питательной среды мицелий Aspergiffus ierreus, культивируемыйдпн получения итаконовой кислоты, промывают аодой об- рабатывают ацетоном при О-5 С, высушивают и измельчают; затемэкстрагируютферментфос фатнымили ацетатным буфером при р Н 4,0-8,0 и температуре , при этом соотношении мицелия к буферному раствору устанавливаю равным 1:6.

Из полученного экстракта осаждают ферменты, осадок отделяют центрифугирсдаанием при 0-8 °С и высушивают.

В качестве осадителей ферментов исполь-. зуют сернокислый аммоний (при насыщении ЗО-65%), метанол, этанол, изопропанол, при этом соотнесение экстракта к осади теля 1:2.

Пример, 0,6 кг 14-дневного мигцелия отделяют от питательной среды, промывают два рааа водопроводной водой, затем деминерализованной водой.

Мицелий отсушивают фильтровальной бумагой и обрабатывают 3 раза 10 л холодкого ацегона (5°С). Отделяют ацетон, мицвлий высушивают в течение 1 ч. Воздушносухоймицелий размельчают, и прсжодят. ancf ракцию 0,1М раствором буфера (рН 7,6) в течение 2 ч при 5 С. Отделяют твердую фазу, белок осаждают сернокислым аммонием при 65%-ном насыщении, Диализуют и лиофильно высушивают. Выход : 1,36 г, активность при рН 1,4-7,1 1 ед/г препарата 17,5 ед/г белка. П р и м е р 2. 0,4 кг 12-дневного мицелия отделяют от пи та тельной среды, промывают водопроводнс водой два раза и окончательно - деминерапиаованной водой. Отжимают и обрабатывают 3 раза 10 л холодного ацетона при 5 С. После отделения ацетона мицелий высушивают и проводят экстракцию О,1М фосфатным буфером с рН 7,6 в течение 2 ч при 5 С. Отделяют твердую фазу, осаждают белок сернокислым аммонием при 40%-ном насыщении. Диализуют и лиофильно высушивают. Выход: 0,15 г препарата с активностью: при рН - 1,4 13 ед/г белка - 5 ед/г препарата при рН - 7,5 13 ед/г белка - 5 ед/г препарата. П р и м е р 3. О,4 кг 12-дневного миц ЛИЯ отделяют от питательной среды, промы вают водопроводной водой (два раза) и окон чательно деминерализованной водой. Мицелий отжимают и 3 раза обрабатывают 10 л холодного ацетона. Отделяют ацетон, мицеЛИЙ высушивают и проводят экстракцию 0,1М фосфатныкг буфером (рН 7,6) в течение 2 ч при 54J. Отделяют твердую фазу, осаждают белок сернокислым аммонием при 65%-ном насыщения. Диалкзуют и лиофильно высушивают;Выход: 0,41 г препарата с активностью: при рН - 1,4 12,3 ед/г белка - 7,6 ед/ препарата при рН - 7,5 9,5 ед/г белка - 6,6 ед/г препарата. П р и м е р 4. 0,6 кг 16-дневного миц лия отделяют от питательной среды, промывают два раза водопроводной водс, затем деминерализованной водой. Отжимают мицелий и обрабатывают 3 раза 11 л холодного ацетона, отделяют ацетон, мицелий высушивают на воздухе под тягой 1 ч, раз мельчают и проводят экстракцию в ОД М фосфатном буфере рН 8, при в течение 2 ч. Отделяют твердую фазу, осаждают бело этиловым спиртом. Центрифугируют при пониженной температуре. Осадок растворяют и лиофильно высушивают. Выход; 1,1 г препарата с активностью; при рН-1,4 16,1 ед/г белка - 6,6 ед/г препарата при рН - 7,5 19,3 ед/г белка - 6,9ед/г препарата. П р и м е р 5. О,4 кг 12-дневного мицелия отделяют от питательной среды, npi мывают водопроподной водой (два раза) и окончательно - деминерализованной водой, мицелий огжимают и обрабатывают три раза холодным ацетоном. Отделяют ацетон и мицелий высушивают в вытяжном шкафу под тягой 1 ч. Размельчают и проводят экстракцию в ЗМ ацетатном буфере при рН 5,4 и в течение 4 ч. Отделяют твердую фазу, осаждают белок метанолом, центрифугируют и осадок лиофильно высушивают. Выход: 0,95 г препарата с активностью: при рН-1,4 19,6 ед/г белка - 5,0 ед/г препарата при рН - 7,5 13,0 ед/г белка - 7,3 ед/г препарата. Примерб. 1,2 кг 12-дневного мицелия отделяют от питательной среды, промывают 2 раза водопроводной водой и деминерализованной водой. Затем мицелий обрабатывают три раза холодным ацетоном с температурой О С. Отделяют ацетон и мицелий высушивают в вытяжном шкафу на воздухе под тягой, размельчают и проводят, экстракцию в 0,1 М фосфатном буфере при . Отделяют твердую фазу, осаждают белок изопропиловым спиртом, центрифугируют, осадок растворяют, диализуют и лиофилизирутог. Выход: 5,6 препарата с активностью: при рН-1,4 30 ед/г белка - 9,6 ед/г препарата при рН - 7,5 20 ед/г белка - 8,2 ед/г препарата. П р и м е р 7. 0,2 кг 4-дневного мицелия отделяют от питательной среды, 2 раза промывают водопроводной водой, затем деминерализованной водой. Мицелий отжимают и обрабатывают 3 раза 5 л холодного ацетона. Отделяют ацетон, и мицелий высушивают в вытяжном шкафу под тягой. Отделяют твердую фазу, осаждают белок этанолом, центрифугируют при 50С и осадок лиофилизируют. Выход: О,45 г препарата с активностью: при рН - 1,4 23,8 ед/г белка - 8,4 ед/г. препарата. Формула изобретения 1. Способ выделения протеопитических ферментов из плесневых грибов, предусматривающий экстракцию и осаждение из них S6

ферментов, отличающийся тем,вляют буферным раствором при рН 4,0-8,0

что, с целью расширения сырьевой базы,и температуре 0-&°С.

выделение ферментов осуществляют иа ми-Источники информации, принятые во вницелия грибов видаА8рег| {Ц1Л terreus, получен-мание при жспертиэе:

ного при производстве итаконоьой кислоты. 1. Сборник дсжладов на Всесоюзной кон2. Способ по п. 1, о т л и ч и и иферениии Внедрение ферментных препаратов

с я тем, что экстракцию фермента осущест-в народное хозяйс зо. Ч 1, М,, 1961 с. 49,

412248