Способ получения онкоовариального кислоторастворимого альфа-2-глобулина Советский патент 1993 года по МПК A61K37/02 A61K35/54 

Изобретение относится к медицине, а именно к медицинской биохимии и может быть использовано для выделения из тканей онкоовариального кислоторастворимого альфэ-2-глобулин-а (КРАГ).

Цель изобретения - разработка способа получения онкоовариального кислоторастворимого альфа-глобулина.

Поставленная цель достигается описываемым способом получения КРАГ из опухолевой и метастатической ткани первичной аденокарциномы яичников путем прогревания экстрактов на кипящей водяной бане 15(5-20 мин) при 95°С, обработки прогретого экстракта равным объемом 10% (5- 15%) трихлоруксусной кислоты, осаждения нерастворимой фракции центрифугированием, фракционирования кислотораствори- мой фракции сульфатом аммония (210-300 г/л), растворения осадка в минимальном обьеме дистиллированной воды и гель- фильтрации его на колонке с сефадексом Ж-100, осаждения сульфатом аммония (210- 300 г/л) фракций, содержащих КРАГ, растворения осадка в дистиллированной воде с последующей гель-фильтрацией его на ко- лонгке с сефадексом Ж-200 в летучем 0,Ш (0,05-0,2М) аммоний-ацетатном буфере (рН - 5,0-7,0) и лиофилизацией фракции, содержащей целевой продукт.

В процессе разработки способа удалось полностью избежать диализа. Эта процедура не только длительная, но и негативно влияет на нати вность многих белков. Все

00 О 00

СО СО СО

этапы данного способа выстроены таким образом, что воспроизведение его до получения целевого продукта занимает 16-20 ч. Новым в предлагаемом способе является то, что в результате последовательного применения описанных этапов в течение 16-20 ч из экстрактов аденокарциномы яичников или ее метастазов в сальник можно получить новый опухолеассоциированный кислотораствори- мый альфа-2-глобулин с чистотой препарата 65-80% и выходом 16,6-25%. Новый онкоо- вариальный кислоторастворимый антиген необходим для разработки специфической иммунодиагностики рака яичников.

При отработке отдельных этапов способа проверены и.обоснованы параметрические значения концентраций, время, температуры, рН, ионной силы и т.д.

П р и м е р 1.100 мл экстракта аденокарциномы яичников, содержащим 30 мг КРАГ, заливают в колбу и помещают в водяную баню, которую разогревают до кипения. Экстракт в колбе периодически перемешивают и замеряют температуру непосредст- в.енно в экстракте. При .подъеме температуры в экстракте до 95-97°С нагрев подолжают в течение 5 мин. Колбу с экстрактом извлекают из бани, охлаждают до 18°С и приливают равный объем 5% трихлорук- сусной кислоты. Тщательно перемешивают, осадок отделяют центрифугированием и доводят рН кислоторастворимой фракции с помощью 2,ОМ едкого натра до рН 7,0. Добавляют сухую соль сульфата аммония из расчета 210 г/л, через 30 мин после полного растворения соли осадок отделяют центрифугированием, растворяют в 10 мл дистиллированной воды и наносят на колонку с сефадексом Ж-100. Объединяют фракции, содержащие КРАГ, добавляют сульфат аммония до концентрации 210 г/л, инкубируют 1 ч, центрифугирую.т, осадок растворяют в 5 мл дистиллированной воды и подвергают повторной гель-фильтрации на сефадексе Ж-200 в летучем аммоний-ацетатном буфере (0,05 М, рН 5,0). Объединяют фракции с молекулярной массой 52-58 кД и лиофили- зируют. После лиофилизации получено 7,1 мг белкового порошка. По данным диск- электрофореза в полиаркиламидном геле чистота препарата КРАГ составила 70%. Следовательно, из 7,1 мг белкового поро.ш- ка на долю КРАГ приходится 5 мг,-что составляет 16,6% выхода.

П р и м е р 2. 100 мл экстракта аденокарциномы яичников, содержащим 30 мг КРАГ, заливают в колбу и помещают в водяную баню, которую разогревают до кипения. Экстракт перемешивают и замеряют температуру непосредственно в экстракте. При

подъеме температуры до 95-97°С нагрев продолжают в течение 1ЕГмин. Экстракт охлаждают до 18°С и приливают равный объем 10% трихлоруксусной кислоты. Перемеши- вают осадок отделяют центрифугированием и доводят рН до 8,0. Добавляют сульфат аммония 270 г/л, после полного растворения соли осадок отделяют центрифугирова- нием, растворяют в 10 мл

дистиллированной воды и наносят на колонку с сефадексом Ж-100. Объединяют фракции, содержащие КРАГ, добавляют сульфат аммония (270 г/л), инкубируют 1 ч, центрифугируют, осадок растворяют в 5 мл дистил5 лированной воды и наносят на колонку с сефадексом Ж-200 в летучем аммоний-ацетатном буфере (0,1 М, рН 6,0). Объединяют фракции с молекулярной массой 52-58 кД и лиофилизируют. После лиофилизации пол0 учено 7,5 мг белкового порошка. По данным диск-электрофореза в полиакриламидном геле чистота препарата КРАГ составила 80%. Следовательно из 7,5 мг белкового порошка на долю КРАГ приходится 6 мг, что

5 составляет 20% выхода.

П р и м е р 3. 100 мл экстракта аденокарциномы яичников, содержащим 30 мг КРАГ, заливают в колбу и нагревают, как в примерах 1 и 2. После охлаждения экстракта к

0 нему приливают равный объем 15% трихлоруксусной кислоты. К полученной кислото- . растворимой фракции добавляют сульфат аммония, из расчета 300 г/л и полученный осадок, растворенный в 10 мл дистиллиро5 ванной воды, хроматографируют на колонке с сефадексом Ж-100. Объединяют фракции, содержащий КРАГ, осаждают его сульфатом аммония (300 г/л), осадок растворяют в 5 мл. дистиллированной воды и хроматографиру0 ют на сефадексе Ж-200 в летучем аммоний- ацетатном буфере (0.2 М, рН 7). Собирают фракции с молекулярной массой 52-58 кД и лиофилизируют. После лиофилизации получено 11,5 мг белкового порошка. По дан5 нымдиск-электрофореза в полиакриламидном геле чистота препарата КРАГ составила 65%. Следовательно из 11,5 мг белка на долю КРАГ составила 65%. Следовательно, из 11,5 мг белка на долю КРАГ

0 приходится 7,5 мг, что составляет 25% выхода.

П р и м е р 4, 100 мл экстракта из ткани метастазов первичного рака яичников в сальник, содержащим 20 мг КРАГ, заливают

5 в колбу и подвергают нагреванию. Далее все этапы аналогичны приведенным в примере. 2. После лиофилизации получено 5 мг белкового порошка. Поданным электрофореза в поилакриламидном геле чистота препарата КРАГ составила 80%.

Следовательно, из 5 мг белкового порошка на долю КРАГ приходится 4 мг, что составляет 20% выхода.

Данный способ может быть применен для выделения КРАГ и из сыворотки крови. Однако концентрация его в сыворотке крови больных раком яичников составляет всего лишь 0,02-0,08 мг/л и выделение его из сыворотки крови представляет интерес скорее теоретический, исключительно для ана- литических целей. Другого биологического материала, из которого можно было бы его получать, пока не найдено.

Контроль за чистотой препарата на этапах выделения осуществляли иммунохими- ческими методами и с помощью электрофореза в полиакриламидном геле. Количественное определение КРАГ проводили иммунохимическими методами.

Опыты по получнию моноспецифиче- ских антисывороток при использовании в качестве антигена препарата КРАГ, выделенного по описанному способу, показали, что препарат обладает достаточной натив- ностью, высокой иммуногенностью, а пол- ученные антисыворотки - высокой специфичностью.

Предлагаемый способ позволяет в обычных лабораторных условиях с помощью доступных реактивов получать но-

вый онкоовариальный кислоторастворимый белок человека. КРАГ необходим для получения к нему моноспецифических антисывороток, которые будут использованы для разработки специфических методов иммунодиагностики рака яичников и исследований в области экспериментальной онкологии и медицины.

Формула изобретения Способ получения онкоовариального кислоторастворимого альфа-2-глобулина, включающий предварительное прогревание при температуре 95-97°С экстрактов из опухолевой или метастатической ткани первичной аденокарциномы яичников в течение 5-20 мин, осаждение балластных белков 2,5-7,5% трихлоруксусной кислотой, внесение в кислоторастворимую фракцию сульфата аммония в концентрации 210-300 г/л, растворение образовавшегося осадка в минимальном количестве дистиллированной воды и проведение гель-фильтрации на колонке с сефадексом G-100, сбор фракций, содержащих альфа-2-глобулин, повторную обработку сульфатом аммония в той же концентрации, проведение гель-фильтрации растворенного осадка на сефадексе G-200 в летучем аммоний-ацетатном буфере, сбор фракций с мол.м. 52-58 кД и лиофизирова- ние.

Использование: в медицинской биохимии для выделения из тканей онкоовариального кислоторастворимого альфа-2-глобулина, необходимого для разработки специфической иммунодиагностики. Цель изобретения: получение нового опухолеассоциированного кис- лоторастворимого антигена. Сущность из обретения: экстракт опухолевой и метастатической ткани первичной аденокарциномы яичников прогревают на кипящей водяной бане5-20 мин при95°С. Прогретый экстрактобрабатывают равным объемом 5-15% трихлоруксусной кислоты. Осаждают нерастворимую фракцию центрифугированием. Фракционируют кислоторастворимую фракцию сульфатом аммония. Растворяют осадок в минимальном объеме дистиллированной воды и подвергают гель-фильтрации его на колонке с сефадексом G-100. Осаждают сульфатом аммония-фракции, содержащие КРАГ. Растворяют осадок в дистиллированной воде с последующей ге.ль-фильтрацией его на колонке с сефадексом G-200 в летучем 0,05-0,2 М аммоний- ац-етатном буфере (рН 5,0-7,0} и лиофилизацией фракции, содержащей целевой продукт. Положительный эффект: изобретение позволяет в обычных с лабораторных условиях с помощью доступ- ных реактивов получать новый онкоовари- f/y альный кислоторастворимый белок - человека.