Способ диагностики туберкулеза у детей Советский патент 1987 года по МПК G01N33/68 

11

Изобретение относится к медицине и биохимии и может быть использовано для изучения изоферментного спектра лактатдегидрогеназы сыворотки крови в период нового реактивного состояния организма после инфицирования его микробактериями туберкулеза.

Цель изобретения - повышение точности способа за счет определения общей активности лактатдегидрогеназы и отношения активности четвертой фракции лактатдегидрогеназы к первой фракции и по значениям этих показателей диагностируют заболевание.

Способ осуществляют следующим образом.

Для получения прозрачного геля используют вымороженные сорта агара, который подвергают соответствующей обработке и чистке: 18 г агара в течение суток промывают проточной дистиллированной водой, расплавляют в 750 мл дистиллированной воды,фильтруют через ватно-марлевый фильтр и выливают в плоскую посуду тонким- слоем, толщиной в 1-1,5 см. После застывания агаровую пластинку разрезают на кубики размером около 1 см и вновь промывают их в течение 2-3 сут в дистиллированной воде.Затем агар разогревают и соединяют (в соотношении 1:1) с вероналмедина- ловым буферным раствором (рН 8,6), добавив 0,02%-ный раствор метиолята из расчета 3-4 капли на 20-30 мл агара для предупреждения его прорастания . Полученный 1,2%-ный агар вновь фильтруют через четырехслой- ный марлевый фильтр и разливают по 80-100 мл в стерильные .колбочки, которые хранятся в холодильнике при t + .

Электрофорез белков проводят в электрофоретической камере, заполненной агаром и мединал-вероналовым буфером (рН 8,6, ионная сила /U 1 0,05), при градиенте напряжения 5 В/см и силе тока 5 МА на одно стело. На предметные, заранее обезжиренные и фиксированные в рамках стекла наносят равномерный слой расплавленного агара (по 5 мл на каждое стекло) .После того как агар застнет, специально изготовленным штампом делают в нем лунки, куда вносят по 0,02 мл негемолизированной сыворотки. Рамку со стеклами помещают в электрофоретическую камеру таким образом, чтобы лунка с нанесенной

07292

сывороткой находилась ближе к аноду. Связь стекол с агаром камеры осуществляют с помощью бумажных полосок - мостиков, смоченных буферным i 5 раствором. Камеру предварительно помещают в охладительный сосуд,заполненный ледяной водой или снегом (температура в сосуде, на время прохождения электрофореза не должна o превышать 5-8 С) . Крышку камеры

плотно закрывают, подключают к блоку питания и устанавливают рабочий режим. Электрофорез белков проводят в течение 2-2,5 ч. Затем аппарат 5 выключают, стекла вынимают и заливают инкубационной смесью, которую готовят непосредственно перед употреблением.

Состав инкубационной смеси: 0 Фосфатный буфер с ph

7,5 при 20°С 10 мл

Молочнокислый натрий

(1М р-р)5 мл

Натрий цианистый 5,25 мг

Магний хлористый 7,15 Мг

НАД (окисленный) 10,0 мг

Тетразолий нитроси-

кий .4,2 мг

Феназинметасульфат 0,025 мг

Инкубация производится в темноте

5

0

при + 37 С в течение 90-120 мин. . После инкубации агаровые блоки про- мывают проточной водой в течение 20 мин, а затем помещают в ванну с

35 дистиллированной водой и промывают до тех пор, пока агар не приобретет первоначальный цвет. Для лучшей отмывки электрофорег рамм иногда используют 2,5%-ный раств.ор глицерина

0 в 2%-ном растворе уксусной кислоты. Затем стекла вынимают, высушивают фильтровальной бумагой и на них отчетливо определяется пять полос фиолетово-синего цвета различной интен45 сивности. Это и есть фракции или изоферменты лактатдегидрогеназы.

Количественная оценка активности отдельных фракхщй лактатдегидрогеназы производилась путем их элю0 ирования в фосфорном буфере (ph 7,4) с последующей фотоэлектроко- лориметрией. Для этого агаровые блоки, содержащие окрашенные полосы, разрезают на равные части, соответ55 ствующие расположению каждой фракции и помещают в пробирке с 3 мл фосфатного буфера. Для контроля берут аналогичные участки прозрачного (неокрашенного) агара. Затем пробир313

ки закрывают резиновыми пробками и ставят в водяную баню (t ) на 10-15 мин.После растворения агара окрашенные в синий цвет растворы (разной интенсивности ) колориметри-- руют на фэке против контроля в кюветах 5 мм при зеленом светофильтре дл X 610 пт. Сумму показаний экстинций всех фракций принимают за 100 и по показаниям экстинций каждой фракции лактатдегидрогеназы высчитывают ее процентное содержание. Отношение величины лактатдегидрогена- зы-4 к величине лактатдегидрогеназы- 1 является показателем коэффициента лактатдегидрогеназы-4 /лактат- дегидрогеназе-1.

Пример 1. Ребенок К. 7 лет. Тематическая карта № 41.

При постановке туберкулиновой пробы отмечен вираж туберкулиновой чувствительности. Проявлений туберкулезной интоксикации и изменений в бронхолегочной системе не выявлено. При электрофоретическом определении активности изоферментов лактатдегидрогеназы активность четвертой фракции составила 12% от общей активности фермента, а коэффициент соотношения активности четвертой фракции к первой равен 0,6. На обзорной рентгенограмме выявлен петрификат в корне легкого, что установило наличие скрытого активного процесса в момент обследования.

Редактор А.Ренин

Составитель И.Емельяненко

Техред Н.Глущенко Корректор О.Тигор

Заказ 1885/41 Тираж 777Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР

по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

294

П р и м е р 2. Ребенок Ш. 10 лет. Через 3 года после ревакцинации БЦЖ, реакция Манту положительная (20 мм). При рентгеногиомографическом обследовании в легких видимых туберкулез- ньк изменений не найдено. При исследовании активности лактатдегидрогеназы получены следующие результаты: активность .четвертой фракции фермента оТ общей активности составила 15,1%. Коэффициент соотношения активности четвертой фракции и первой равен 0,69. Диагноз: первичное инфицирование туберкулезом.

Пр ёдлагаемый способ (по сравнению с известными) значительно повьппа- ет диагностику за счет возможности выявления скрытой активности туберкулезного процесса виражных детей,

которую нельзя определить ни клинико- рентгенологическими, ни другими лабораторными методами исследования.

Формула изобретения Способ диагностики туберкулеза у детей путем определения активности изоферментов лактатдегидрогеназы с помощью электрофореза, отличающийся тем, что, с целью повы- шения точности способа, по увеличе- нию относительно общей активности лактатдегидрогеназы более 10% и нарастанию соотношения активности четвертой фракции лактатдегидрогена- зык первой фракции более 0,4% диагностируют туберкулез.

Изобретение относится к медицине и биохимии, предназначено для изучения изоферментного спектра лак- татдегидрогеназы сыворотки в период нового реактивного состояния организма после инфицирования его микробактериями туберкулеза. Цель изобретения - повьшение точности способа путем определения общей активности изоферментов лактатдегидрогеназы с помощью электрофореза. Электрофорез проводят в злектрофоретической камере, заполненной агаром и мединал-ве- роналовым буфером (рН 8,6 ионная сила /t 0,05) при напряжении 5 В. Затем определяют отношение активности четвертой фракции ла статде- гидрогеназы к первой фракции. По увеличению относительно общей активности лактатдегидрогеназы более 10% и нарастанию соотношения активности 4-й фракции лактатдегидрогеназы к 1-й фракции более 0,4% диагностируют туберкулез. W to со