Штамм 62-продуцент тирозинфеноллиазы Советский патент 1980 года по МПК C12D13/10 

Изобретение относится к области микробиологии и касается получения бактериальных ферментов. Известен штамм Citrobacter freun- dii АТСС 6750-продуцент тирозинфенол лиазы, характеризующийся рядом куль турно-морфологических и физиологобиохимических признаков 1. Однако известный штамм обладает низкой активностью тирозинфеноллиаэы. Выход тирозина составляет 52 г/л за 42 ч. Целью изобретения является получ ние шталяла, обладающего высокой активностью тирозинфеноллиазы. Штамм Citrobacter freundii 62 получен из ила Московской области. Штамм Citrobacter freundii 62 хранится в коллекции культур микроорганизмов Московского государствен ного университета им.М.В.Ломоносов под номером 62, Культурально-морфологические при знаки. Мелкая грамотрицательная палочка размером на фиксированных окрашенны препаратах 0,4-0,5x1-2 мкм, подвижная, с перитрихиальным жгутикованиём. Спор не образует. Мясо-пептонный агар. Грязно-белые блестящие плоские крупные колонии. Среда с .муравьинокислым кальцием и пептоном образуют твердую пленку мел а. Физиолого-биохимические признаки. Факультативный анаэроб. Усваивает лимонную кислоту. Индол не образует. Сероводород образует. Проба с метилрот положительная. Реакция Фогес-Проскауэра отрицательная. Усваивает с образованием кислоты и газа арабинозу, галактозу , глюкозу, ксилозу, лактозу, мальтозу, глицерин . Не сбраживает сахарозу, декстрин, дульцит, инозит. Продуцирует тирозинфеноллиазу. Пример 1.Citrobacter freundii 52 поддерживают в пробирках на жидкой среде, образованной из муравьинокиспого кальция 2% и пептона 0,5% на.водопроводной воде, рН 6,8-7,0. Отсюда несколько капель переносят в пробирки со скошенным мясо-пептонным агаром.. Выращивают при , затем

пересевают в пробирки со скошенным

агаром среды, содержащей, %: Пептон 1fOI NaCI0,i

KCI0,1

Дрожжевой авто-лиэат 0,5 /сухого ве-щества) Тирозин 0,02

Агар1/5

ВодаОстальное,

рН6,6-6,8.

Выращивсцот 2 сут. при 30°С, saxeNl смывают бактериальный наЛет стерильной водой и взвесь используют в качестве посевного материала из расчета: смыв с одной пробирки на 5-6 колб, каждая со 100 мл среды следующего состава, %:

Бульон Хо1-

тингера 50 мл на 100 мл среды

Дрожжевой

автолизат1,0 (сухого вещества)

Пептон.0,5

Тирозин0,2

Пиридоксин0,01

ВодаОстальное.

Культивируют на качалке при 200 об/мин в течение 23 ч. Клетки со 100 мл среды отделяют центрифугированием и вносят в 50 мл субстрата следующего состава, %:

Фенол1,0

Пируват

натрия4,0

Аце та т

аммония5,0

Эдта0,1

Дистиллированная

водаОстальное.

рН8,0 устанавливается аммиаком.

Смесь выдерживают на качалке при 200 об/мин и температуре 30°С. Периодически дополнительно вносят фенол, по 0,25 г на 50 мл субстрата через 1,5 ч-всего 7 раз. Общее ко личество внесенного фенола - 45 г н 1 л субстрата. За 7 ч инкубации вносят по 1 г пирувата натрия на 50 мл субстрата. Через 12 ч инкубации получают тирозин в количестве 75,0 г на 1 л субстрата.

Пример Z.Citrobacter treund 62 выращивают и ставят реакционную смесь по примеру 1. Дополнительно вносят фенол восьмой . раз на 12-ый час инкубации. Общее количество фенола 50 г на 1 л сустрата. Через 24 ч от начгша инкубации получают тирозин в количестве 86,5 гн% i л субстрата.

Пример 3.Citrobacter freimd 62 вьгращивгиот по примеру 1.Клетки с 60 мл среды отделяют центрифугированием и вносят в 20 мл субстрата,содержащего , %:

Пирокатехин 4,0 Борная

кислота2,2

-Пируват

натрия3,0

Ацетат аммрния3,0

. NagSO 0,2

oЭДТА0,1

Дистиллированная

водаОстальное

рН8,0 доводят амс миаком.

Смесь выдерживают на качалке при 17-19с. Через 21 ч инкубации получают ДОФА в количестве 23,5 г на 1 л субстрата.

П р и м е р 4. Посевной материгш 0 Citrobacter freundii 62 подготавливают по примеру 1. Смывают бактерии с пробирки скошенного агара и засевают среду, содержащую,%:

Автолизат

5БВК3,0

K HPO -SHjO0,3

NaH2PO40,1

,1

,001

0Тирозин0,2

Пиридоксин0,01

Водопроводная водаОстальное рН6,6-6,7 5 Культивируют в конических колбах на 750 мл со 100 мл среды на качалке с 200 об/мин при 23 ч. Клетки С. 50 мл среды -отделяют центрифугированием и вносят в 50 мл субстрата для синтеза тирозина (по приме ру 1). Через 2 ч инкубации на качалIke при получают тирозина 18,1 г/л.При дополнительном внесении фенола по 0,25 г на 50 мл субстрата на второй и третий час инкубгщии 5 (общее количество внесенного фенола 20 г/л) через 6 ч от начала инкубации получают тирозина 38,0 г/л. При выдерживании клеток в субстрате для синтеза ДОФА (по примеру 4) 0 получают через 22 ч инкубации ДОФА 20,0 г/л.

Использование изобретения позволяет получить высокоактивную тирозинФеноллиазу в более короткие сроки г (В№сдд гирозина составляет 85-86 г/л за24 ч).

Формула изобретения

60111та м Citrobacter freundii 62

-продуцент тирозинфеноллиазы.

Хранится в коллекции культур микроорганизмов Московского государственного университета им.М.В.Ломоносо65 ва под номером 62,

Культурально-морфологические признаки.

Мелкая грамотрицательная палочка размером на фиксированных окрашенных препаратах 0,4-0,Ьх1-2 мкм, подвижная, о перитрихиальным жгутикованием. Спор не образует.

Мясо-пептонный агар. Грязно-белые блестящие цлоские крупные колоНИИ ,

Среда с муравьинокислым кальцием и пептоном. Образует твердую пленку мела.

Физиолого-биохимические признаки

Факультативный анаэроб.

Усваивает лимонную кислоту.

Индол не образует.

Сероводород образует.

Проба с метилрот положительная.

Реакция Фогес-Просиауэра отрицательная.

Усваивает с образованием кислоты и газа арабинозу, галактозу, глюкозу, ксилозу, лактозу, мальтозу, глицерин .

Не сбраживает сахарозу, декстрин, дульцит,1 инозит.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Патент США 3791924, КЛ. 195-29, 1974.