Штамм @ @ м 35-продуцент @ -триптофана на этаноле Советский патент 1986 года по МПК C12P13/22 

Изобретение относится к микробиологической промьшшенности и касается получения нового штамма, продуцирующего L-триптофан.

Цель изобретения - получение штам ма-продуцента L-триптофана, обеспечивающего увеличение выхода целевого продукта при использовании более простой по составу минеральной среды содержащей этанол в качестве источ- ника углерода и энергии.

Предлагаемый штамм Pseudomonas species М35 - продуцент L-триптофана находится на хранении в Центральном; музее промьшшенных микроорганизмов Института ВНИИГенетика лод регистрационным номером В-3038.

Штамм Pseudomonas species М35 получают как мутант в результате 4-ступенчатой селекции на продуктив- ность L-триптофана с использованием в качестве мутагена Ы-метил-Н -нитро -N-нитрозогуанидина, а в качестве селектирующего фактора - структурный аналог L-триптофана - 5-метил-DL- -триптофан. Исходным для получения мутанта служит штамм дикого типа Pseudomonas species, вьщеленньй из сточных вод Минского завода медпрепа ратов.

На каждом этапе селекции клетки штамма в логарифмической фазе роста обрабатьшают Ы-метил-К -нитро- К-нит- розогуанидином (100 мкг/мл в течение 30 мин при 28°С в цитратном бу- фере, рН 5,5) и высевают на агари- зованную среду следующего состава,%; lNa2HP04 (безводный) - 0,6- KHjjP040, NaCl U,U5; 0,1; CaCl 0,0015; MgS04 7H20 0,2; фруктоза 0,2, агар 1,5; рН 7,0. 5-Meтил-DL-тpиптoфaн растворяют в спирте и добавляют в готовую среду перед употреблением , до конечной концентрации 100, 500, 1000 ,и 10000 мкг/мл соответственно при каждом последунядем этапе селекции. Бактерии культивируют при 28°С в течение 5-7 дн. Выросшие колонии пассируют повторно- на среде указанного состава и проверяют затем на продукцию L-триптофана, отбирая каждый раз наиболее продуктивные варианты. L-Триптофан определяют по известной методике.

В результате выделен мутант, от- личающийся от дикого типа устойчивостью к ингибирующему действию высоких концентраций, 5-мeтил-l)L-триптофана. В отличие от известного свойства нового штамма позволяют получит больший выход L-триптофана при культивировании на более простой по составу минеральной среде (без витаминов и микроэлементов), содержащей в качестве источника углерода и энергии этанол.

Штамм Pseudomonas species М35 характеризуется следующими признаками . .

Морфологические признаки. Клетки прямые, палочковидной формы с округлыми концами, 0,6-2 - 3jn, подвижные с 2-4 монополярными жгутиками, грам- отрицательные, спор не образуют.

Культуральные признаки. Колонии на агаризованных питательных средах (мясо-пептонном агаре, Кинг В агаре) гладкие, плоские, круглые, край ровный, серовато-белые. Через 24 ч , выращивания при 28 С образует :колоНИИ размером 1-2 мм. Рост по уколу в МПА умеренный, в основном на поверхности среды. В жидких питательных средах образует интенсивную муть. Хорошо растет на минеральных средах простого состава, не требует ростовых факторов.

Физиолого-биохимические признаки По отношению к кислороду - облигат- ньй аэроб. Оптимальная температура роста 28-30°С, рН среды 6,8-7,3. Азот утилизирует в виде солей аммония, мочевины, нитратов.

Пигменты. Образуют желто-зеленый водорастворимый флюоресцирующий пигмент на среде Кинг В. Внутриклеточного пигмента не образует.

Реакция на оксидазу и каталазу положительная. Реакция Фогес-Проска- уэра отрицательная. Индол не образует. Аммиак образует. Сероводород не выделяет. На питательных средах,, содержащих 5%-ный раствор сахарозы, леван не образует. Тест на анаэробную денитрификацию отрицательный. Реакция на анаэробную аргинин- дегидролазу положительная, Лецити- назная активность отсутствует.

Не гидролизует крахмал, желатину, Твин-80.

В качестве источников углерода использует: глюкозу, глицерин, сахарозу, галактозу, мальтозу, фруктозу, этанол, метанол, тирозин, фенилаланин, орнитин, глицин, лейцин, глютаминовую йислоту, аспараги3 . новую кислоту. .Не утилизирует: ара- бинозу, маннозу, ксилозу, лактозу, маннит, раффинозу, дульцит, сорбит, целлобиозу, инозит, серии, антра- ниловую кислоту, ацетамид, лизин, триптофан.

Идентифнкахщю бактерий щтамма Pseudomonas species М35 производят согласно Bergey.

Пример 1.С косяка петлей делают посев культуры Pseudomonas species М35 в пробирки с ами- нопептидным бульоном (рН 7,0, объем 2-3 мл). Посевной материал выращивают при в течение 18 ч. Готовый посевной материал вносят в количестве 3-5% (по объему) в пробирки (20 мл в диаметре, высота 10 см), содержащие 5 мл ферментационной среды. .Ферментационную среду стерилизуют при 0,5 атм в течение 30 мин. Перед употреблением добавляют зтанол и затем разливают по пробиркам. Состав ферментационной среды следующий, %:

NajHP04

(безводный) 0,6

KHjP04

(безводный) 0,3

NaCl0,05

Составитель Н.Афанасьева Редактор Н.Яцола Техред 3,ПалийКорректор С.Шекмар

Заказ 8651/26 Tиpaж 490Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР

по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушская Ha6i, д.4/5

Филиал ППП Патент, г.Ужгород, ул.Проектная, 4

06306 ;

NH4C10,1

CaCla0,0015

MgS04 7H20 0,2 Этанол 1,5 5 После 72 ч вьфащивания (рН 7,0) на качалке (240 качаний/мин) при 28°С в культуральной жидкости накап ливается 0,3 г/л L-триптофана.

Пример 2. Выращивание по- 10 севного материала, а также состав ферментационной среды как в примере 1. Засев посевного материала в количестве 3-5% (по объему) делают в колбы Эрленмейера (емкостью 15 250 мл), содержащие 50 мл фермента-- ционной среды.

После 72 ч вьфащивания на качалке (240 качаний/Мин) при 28 С в культуральной жидкости накапливается 20 0,63 г/л L-триптофана.

Использование штамма Pseudbmonas species М35 позволяет в 20 раз увеличить выход L-триптофана по сравне25 нию с известным штаммом Pseudomonas species 5МТ при культивировании на простой по составу минеральной среде (без витаминов и микроэлементов), содержащей в качестве источника уг30 лерода и энергии этанол.

.Шта,мм Pseudomonas species М35 - (коллекция Центрального музея промыш- ленных микроорганизмов Института ВНИИГенетика, коллекционный номер ЦМПМ В-3038) - продуцент L-триптофа- на на этаноле.