Способ культивирования вирусов Советский патент 1981 года по МПК C12N7/00 

1

Изобретение относится к области медицины, а именно вирусологии, и может найти применение для культивирования вакцинных штаммов вируса.

Известен способ культивирования вирусов путём-размножения на линии диплоидных клеток 1.

Однако этот способ является малодоступным, кроме того, линии-клеток высоко чувствительны к определенным питательным средам и сывороткам.

Цель изобретения - упрощение способа.

Это достигается тем, что вирусы размножают на линии диплоидных клеток кожи и мышц эмбриона человека М-7.

Полученная Линия диплоидных клеток кожи и мьашц эмбриона человека М-7 имеет следующие биологические, генетические и морфологические характе-рисгики.

Культура состоит из фибробластоподобных клеток. Морфология клеток остается стабильной в течение фазы активного роста.

.Клетки легко снимаются со стекла раствором трипсина, при субкультировании быстро прикрепляются к стеклу и на 3-4 сутки образуют монослой. Клетки хорошо растут на среде Игла

и среде MEM с 10% сыворотки крупного рогатого скота, коэффициент развивки составляет 1:2, 1:3.

Клетки имеют ограниченное время жиэни вне организма, до 66 пассажа, на протяжении фазы активного роста не теряют своих генетических свойств. При. кариологическом анализе установ- лено, что модапыный класс на уровне

10 десятого, двадцатого, тридцатого и сорокового пасссокей составляли клетки с двойным набором хромосом (2п-46). Число диплоидных клеток на протяжении фазы активного роста колебалось от

15 97% на ранних пассажах до 85,6% на поздних, гипоплоидных - 1,6-2,0, гиперплоидных - 1,0-12,8. Обследовано 1200 метафаз. Установлено, что кариотип диплоидных клеток не отли20чается от кариотипа, хара терного дпя мужского пола. При сравнении хромосомных наборов на разных уровнях пассажей различий не обнаружено, что свидетельствует об отсутствии

25 контаминации линии другими клеткают. Различий также не выявлено в рисунке дифференцированности хромосом по длине при окраске по Гимза, что также указывает на генетическую стабильность

30 культуры.

Клетки линии М-7 не контаминированы бактериями, грибами и микоплазмами. Посторонние вирусы не выявлены ни в культурной жидкости, ни в клетках. .ы на рнкогенность также были отрицательными .

По мере размножения клетки замораивсши на различных уровнях пассажей для хранения в жидком азоте, таким обазом создан их банк. При восстановлеии клетки сохраняли жизнеспособность. а70-80 %.

Клетки линии чувствительны к разичным вирусам группы ECHO, Кокс&ки, полиомиелита и клещевого энцефалита. В частности, характер цитопатических зменений под действием вируса полиомиелита штаммов Сэбина по морфологии и срокам развития не отличается от наблюдаёмого в первичной культуре клеток почек обезьян, используемых ля йз готовления вакцины против полиомиелита и клещевого энцефалита, В частности, характер цитопатических изменений под действием вируса полиомиелита штаммов Сэбина по морфологии и срокам развития не отличается от аблюдаемого в первичной культуре клеток почек обезьян, используеких для изготовления вакцины против полиомиелита.

Вирусклещевого энцефалита в клетках линии М-7 размножается со стабильно высокими показателями титров,чего не -наблюдается при заражении первич- ных культур клеток куриного эмбриона, используемых для изготовления вакцины против клещевого энцефалита.

Приводятся примеры культивирования вирусов на линии диплоидных клегок кожи и мышц эмбриона человека М-7.

Пример 1. Способ культивирования вируса полиомиелита,штамм Сэбина 1 Типа.

В матрасную колбу с диплоидными /клетками кожи и мышц эмбриона человека М-7 на уровне I пассажа вводят 0,25 %-ный раствор трипсина, подог-ретый до 37°С. Через 10 с раствор УДалТдют, а сосуд .тками помещают в термостат при температуре З7с йй 2 мин. .После этого в него вносят неёольшое количество дит.ательной среды и энергичным встряхиванием заканчивают процесс отделёнйя йлётоК от с Шгла. Затем в клеточную взвесь добавляют среду роста - среду НЕМ с 10% сыйоротки крупного рогатого скота, и разливают на две матрасные колба, Эти культуры 19 пассажа инкубируют при 37°с в течение 4 суток до момента формирования плотного слоя.

При заражении вирусом среду из хультуральных Сосудов слИвают, клетки трижды про Ф1вают раствором Эрла и вводят вируссодержащую жидкость из расчета 3 БОЕ на клетку. Затем добавляют поддерживающую среду, в качестве КйтороЯ используют среду MEM,

Инфицированные культуры инкубируют при 34С. Сбор вируса. производят на

4день после зарал ения и определяют его титр по методу образования бляшек. Титр равен 7,7.д БОЕ/мл.

Параллельно аналогичным способом инфицируют первичную культуру клеток почек обезьян, и вирус в ней размнорсается до титра 7,5 Хд БОЕ/мл,

При мер 2, Способ культивирования вируса полиомиелита, штамм Сэбина П типа,

клетки линии М-7 на уровне 19 пассажа получают и заражают вирусом по способу, описанному в примере 1, При этом титр вируса как при размножении его в данной культуре, так и в первичной культуре клеток почек обезьян составляет 7,5 1д БОЕ/мл.

Пример 3. Способ культивирования вируса полиомиелита, штамм Сэбина I I I типа.

Клетки линии М-7 на уровне 19 пассажа получают И заражают вирусом по способу, описанному в примере 1. При этом титр вируса как при размножении его в данной культуре, так и в первичной культуре клеток почек обезьян составляет 7,5 1д БОЕ/мл,

П р и м е р 4. Способ культивирования вируса ECHO Л.

Клетки линии М-7 получают и готовят к зараокению по способу, описанному в примере 1. При заражении вносят вируссодержащую жидкость из расчета

1БОЕ на клетку. Для ащсорбции вируса культуры выдерживают при в течение-1,S ч, после чего добавляют поддерживающую среду. Культуры инкубируют при.37°С, сбор вируса проводят через 5 дней после заражения, затем определяют его титр, который равен 7,3 Вд БОЕ/МЛ.

Параллель;но аналогичным способом заражают первичную культуру клеток почек обезьян и вирус в ней размножается до титра 6,5 9 БОЕ/мл.

П р и м е р 5 . Способ культивирования вируса ECHO 12.

Клетки линиим-7; получают и гото йят к заражению по описанному в примере 4 способу. При заражении вносят вируссодержащую жидкость из расчета

2БОЕ на клетку. Вирус собирают на

5день после заражения и его титр равен 7,6 Eg БОЕ/МЛ, При параллельном заражении аналогичным способом первичных культур клеток почек обезьян титр вируса достигает лишь 5,7 tg ВОЕ/мл.

П р и м е р 6. Способ культивирования вируба Коксаки в 5.

Клетки линии М-7 получают и заражают по способу,указанному в примере 5.

Титр вируса при размножении в данной культуре составляет 7,4 9 БОЕ/мл а в параллельно инфицированной анологичным способом kyльтype клеток почек обезьян - 6,45 ig БОЕ/мл, Пример 7. Способ культивирования вируса клещевого энцефалита, штамм Софьин, Линию клеток на уровне II пассажа готовят аналогичным способом, описан ным в примере 1. Культуру трижды отмывают раствором Эрла и вводят вирус содержащую жидкость из расчета 0,002 LD o/клетку. Адсорбцию вируса проводят при 32С в течение 1,5 ч пр постоянном покачивании. В качестве подцерживгиощей среды используют среду 199 на растворе Эрла с 5% аминопептида - 2, и по 0,1 % куриного эмбрионального экстракта, человеческого альбумина и гидролизата лактальбу мина. Культуры инкубируют при З7с в .течение 48 ч и производят сбор вируса. Степень его размножения определяют в опытах биологического титрова-. ния путем интрацеребрального зараже ния кмшей. При этом титр составляет 8,02 LDSO. Параллельно аналогичным способом инфицируют первичные культуры клеток куриного эмбриона и титр вируса; в этом случае равен 7 Iq . Предлагаемый способ позволяет использовать для культивирования вирусов новогхэ субстрата, полученного из легкодоступного абортивного материала (кб жи и эмбриона человека) , легко культивируемого, обладающего диплоид ным набором хромосом, свободного от посторонних агентов, чувствительного к различным вирусам, лишенного онкогеннойактивности. Линия диплоидных клеток кожи и млац эмбриона М-7 человека отличается легкостью получения и субкультивирования при использовании ростовой среды Игла или среды MEM с добавлением 10% качественной сыворотки крупного рогатого скота, не требует особых видов питательных и дефицитной эмбриональной сыворотки телят, обладает устойчивыми морфологическими и генетическими особенностями. Линия чувствительна ко многим вирусам, что открывает перспективы широкого применения ее в вакцинном производстве. Ее клетки хорошо сохраняются в жидком азоте и можно создават1г их запас. Использование линии в производстве вакцин позволит снизить импорт обезьян и готовить большие партии вакцин на заранее отконтролированном клеточном субстрате. Применение его в качестве лабораторной модели вместо первичных культур клетой и животных позволит получать более достоверные данные с меньшими экономическими затратами. Формула изобретения Способ культивирования вирусов путем размножения на линии диплоидных клеток, о т ли ч а ю щ и и ся тем, что, с целью упрощения способа, вирусы размножают на линии диплоидных клеток кожи и мышц эмбриона человека М-7. Источники информации, принятые во внимание при экстге) 1. HayMick and Moorhead. The Serial Cultiva.tion of Diploid Cell Strains. Experimental Cellulior Research, 25, 3, p. 585-621.