Способ культивирования вирусов Советский патент 1981 года по МПК C12N7/00 C12R1/91 

1

Изобретение относится к вирусоло гии.

Известен способ культивирования вирусов Путем размножения на линии перевиваемых клеток почки обезьяны

Недостатком известного способа

является отсутсвие стандартных свойств отдельных клеток, подцерживаег х в разных лабораториях мира, а также контаминация посторонними агентами. Кроме того, в нем используется дифицитная эмбриональная сыворотка.

Цель изобретения - упростить способ.

.Эта цель достигается тем, что вирусы размножают на линии перевиваемых клеток почки взрослой зеленой мартышки 4647.

-. Полученная линия клеток почек взрослой зеленой мартышки 4647 имеет следующие морфологические и биологические свойства.

Культура представлена округлыми эпителиоподобными клетками, цитоплазма не вакуолизирована, ядро срдержит мелкозернистый гетерохроматин и 12 ядрышка.

Клетки линии 4647 образуют монослой на вторые сутки после субкультивирования, причем монослой удается получать даже при внесении в 1,5-литpOByft матрасную колбу 410° клеток. Время удвоения популяции составляет 24 ч. Коэффициент развивки достигает величин 1:2, 1:3. ДтГя пассирования клеток используют смесь основной

10 среды Игла с 0,5%-ным гидролизатом лактальбумина и 5-10% сыворотки крупного рогатого скота. Клетки линии 4647 сохраняются в жидком азоте более двух лет без снижения проли5 феративной активности , способны длительное время оставаться на стекле без субкультивирования и смены среды, а также выдерживать в течение 21 дня агаровое покрытие с аминопеп20тидом и бикарбонатом- натрия.

Клетки линии 4647 чувствительна к различным вирусам: вакцинному штамму вируса чумы плотоядных, вакцинным штаммам вируса полиомиелита, пенящим

25 вирусам, а также к цитомегаловирусу обезьян.

Пример 1. Способ культивирования вируса чумы плотоядных Г

В 1,5-литровую матрасную колбу с 30 перевиваемыми клетками почек взрослой зеленой мартышки 4647 на уровне 47 пассажа вводят 0,25%-ный раствор трипсина, подогретый до 37Ос. Через 30 с трипсин удаляют, а сосуд с клет ками помещают в термостат при на 3 мин. Затем оставшиеся клетки ресуспендируют в С1эеде роста - смесь О ,5%-ного згидролизата лактальбумина; на растворе Хенкса со средой ТТгла в равных количествах и 10% сыворотки крупного рогатого скота.Взвесь разли вают на две матрасные колбы. Эти культуры на уровне 48 пассажа инкубируют при s течение 2 суток до момента формирования сплошного слоя. При заражении вирусом среду слив ют из культуральных сосудов, клетки однократно промывают раствором Эрла и в каждую матрасную колбу вводят по 10 мл жидкости, содержащей 3,39 БОЕ/МЛ вируса. Для адсорбции вируса культуры выдерживают при З4с в течении 1 ч при постоянном покачивании, после чего добавляют поддерживающую среду - смесь 0,5%-ного гидр лизата локтальбутина на растворе Эрла со средой Игла в равных количествах и 5% аминопептида. Инфициро ванные культуры инкубируют при 34С На пятые сутки поддерживающую среду удаляют и в сосуды наливают новые порции среды того же состава. Сбор вируса проводят на 8 день после заражения и определяют его титр по методу образования бляшек. Титр равен 5,3 1g БОЕ/МЛ. При культивировании вируса Б, пер вичной культуре клеток почек обезья титр вируса достигает 4,0 Ig БОЕ/мл Пример 2. Способ культивир вания вируса полиомиелита, штамм. Сэбина 1 типа. Клетки перевиваемой линии 4647 получают и готовят к заражению по описанному в примере 1 способу. При заражении вирусом полиомиели та, штамм Сэбина 1 типа, среду из культуральных сосудов сливают, клет ки промывают раствором Эрла и вводят вИРУсодержащую жидкость из расч та 3 БОЕ на клетку. Затем добавляют поддерживающую среду, в качестве ко торой используют смесь 0,5%-ного гидролизата лактальбумин а на раство ре Хенкса со средой Игла в равных количествах. Инфицированные культуры инкубируют при . Сбор вируса производят на четвертый день после заражения и определяют его титр по методу образования бляшек. Титр составляет 7,5 -Ig БОЕ/МЛ. При культивировании вируса в пер вичной культуре клеток почек обезья получаются аналогичные результаты. Пример 3. Способ культивирования пенящего вируса обезьян. Клетки линии 4647 на уровне 45 пассс1жа определяют от стекла по методу, описанному в примере 1, и эксплантируют в.литровую роллерную бутыль в количестве 60.iO клеток. Культуру инкубируют при 370с во вращающемся состоянии со скоростью 18 об/ч в течение 24 ч до момента формирования монослоя. При заражении вирусом среду из культуральных сосудов слива- ют, клетки промывают физиологическим раствором и вводят вирус из расчета Ю в объеме 30 мл поддерживающей среды. Вращательным движением вируссодержащую жидкость равномерно распределяют по монослою .Адсорбцию вируса проводят при 37 в течение 1 ч при постоянном вращении Затем вИРУсодержащую жидкость удаляют, а в сосуд вводят мл поддерживающей среды с 1% сыворотки телят. Культуральные сосуды помещают в барабан и вращают с той же скоростью при в течение 4 дней. После этого, проводят сбор вируса с последующим титрованием по развитию цитопатического эффекта. Титр вируса составляет . Параллельно этим вирусам,заражают культуру клеток почек обезьян в матрасной колбе, находящейся в стационарном положении. В ней вирус размножается до титра ТЦД„/мл. Для получения антигена к пенящему вирусу клеточный пласт снимают замораживанием в смеси спирта с сухим /льдом. Разрушенные клетки осаждают центрифугированием в течение 15 мин при 2000 об/мин. Надосадочную жидкость используют в качестве антигена и сохраняют при температуре -Ю-С. Нормальный антиген из незараженных клеток 4647 получают в аналогичных условиях. Перед использованием в РСК антигены предварительно проверяют на антикомплементарную специфичность.и антигенную активность. Предла гаемый способ позволяет расширить виды клеточных субстратов, используемых для культивирования вирусов . Применение перевиваемой линии клеток почек взрослой зеленой мартышки 4647 приводит к уменьшению экономических затрат для культивирования вирусов в связи q тем, что может заменить дорогостоящие первич- . ные клетки почек обезьян. Кроме, того клетки линии 4647 обладают стандартными биологическими и морфологическими свойствами, не содержат мико-плазм, имеют высокую пролиферативную активность, легко культивируются на отечественных средах и сыворотках, не теряют своих свойств при хранении в жидком азоте и имеются в запасе. Использование для культивирования вирусов клеток линии 4647 расширит 577 возможности успешной диагностики вирусных инфекций, позволит получать в значительных количествах антигены пенящего вируса и цитомегаловируса обезьян, приготавливать вакцины для ветеринарной практики. Формула изобретения Способ культивирования вирусов путем размножения на линии перевиваемых клеток почки обезьян, о т л и 01956чающийся тем, что с целью упрощения способа, вирусы размножают на линии перевиваемых клеток почки взрослой зеленой мартышки 4647. Источники информации, « принятые во внимание при экспертизе 1. Hopps H.E.at.al. Biological characteristics of а serlalli cultivated kidney cells derived from the african green monkey, Cercopithecus .. aethiops. Fed ration Proceedings, 1962, 21,454.