Штамм бактерий ЕSснеRIснIа coLI Советский патент 1992 года по МПК C12N15/31 C12N15/31 C12R1/19 

Изобретение относится к биотехного- гии и, в частности к генетической инженерии, и представляет штамм, полученной методом генетической инженерии и содержащий в составе рекомбинантной плазми- ды детерминанту резистентности к гентамицину, сизомицину, тобрамицину и нетилмицину, обусловливающую синтез 3 -аминогликозидацетилтрансферазы типа Па.

З -аминогликозидацетилтрансфераза типа На - фермент, продуцируемый клиническими штаммами микроорганизмов и обусловливающий инактивацию таких клинически важных антибиотиков, как гентами- цин, тобрамицин, сизомицин и нетилмицин, в результате чего продуцирующий этот фермент штамм микроорганизма приобретает резистентность к перечисленным антибиотикам.

Целью изобретения является создание генно-инженерного штамма, содержащего в своем составе ген аасС2а, и продуцирующего З -аминогликозидацетилтрансферазу типа Па.

Ген аасС2а, входящий в состав рекомбинантной плазмиды. может быть использован для конструирования ДНК-зонда, используемого при детекции гена аасС2а или близкородственных ему генов методом ДНК-ДНК гибридизации.

Для достижения поставленной цели была сконструирована рекомбинантная плаз- мида pSV11, состоящая из векторной плазмиды pUC19, в полилинкер которой встроен Hindlll фрагмент клонированной и секвенированной детерминанты резистентности, содержащей ген аасС2а. При помощи метода Сэнгера определена нуклеотидная последовательность этой детерминанты резистентности.

СО

С

XI

О 00

о VI

Нуклеотидная последовательность клонированного из клинического штамма E.coli и секвенированного нами Hindll фрагмента ДНК приведена в таблице.

Ген, входящий в состав секвенирован- ной детерминанты резистентности, содержит открытую рамку считывания размером 856 п.н., кодирующую фермент ААС(3)-Па и локализованную между 819 и 1676 нуклео- тидами, начиная от 5 конца. Показано, что ген кодирует белок мол.м. 30,6 килодальтон.

При сравнении последовательности структурной части секвенированного гена с последовательностями структурных частей генов аасС2 плазмид pWP14a, pWP116a, pJV03 и pWP113a обнаружено в общей сложности 43 нуклеотидные замены, определившие 20 аминокислотных замен в молекуле фермента, т.е. наблюдается 5,0% различий в нуклеотидном составе и 7,3% - в аминокислотном.

Выявлено, что секвенированный ген содержит отличный от известных ранее промотор и ряд нуклеотидных замен в структурной части. На основании определения степени гомологии секвенированного гена с известными генами аасС2, секвенированный ген отнесен к типу аасС2а.

Сконструированной рекомбинантной плазмидой, имеющей в своем составе секвенированный ген аасС2, трансформируют лабораторный штамм E.coli К 12 JM101.

Для достижения цели использован штамм Escherichia coli коллекция ВНИИА N 2075 - содержащий рекомбинантную плаз- миду pSV11, содержащую в своем составе фрагмент с геном ассС2а. Штамм получен трансформацией штамма E.coli JM101 плазмидой pSV11,

Штамм Escherichia coli коллеция ВНИИА N 2075 характеризуется следующими- признаками.

Морфологические признаки.

Клетки прямые, палочковидной формы 1,2-1,6x2,0x6,0 мкм, подвижные, с перитри- хиальными жгутиками, грамотрицательные, неспороносные.

Культуральные признаки.

Клетки хорошо растут на простых питательных средах.

При росте на мясо-пептонном агаре, питательном агаре Дифко - колонии гладкие, круглые, прижаты, блестящие, серые, край ровный, мутные.

При росте в жидких средах: мясо-пептонном бульоне, L-бульоне образуют ровную, интенсивную муть.

Физиолого-биохимические признаки.

Клетки растут в пределах 4 - 45 С при оптимуме рН 6,8 - 7,5.

Проявляют устойчивость к ампициллину, обусловленную наличием гена Ыа в векторной части плазмиды pSV11, а также резистентность к гентамицину, сизомизину,

тобрамицину и нетилмицину, обусловленную геном аасС2, входящим в состав рекомбинантной плазмиды pSV11.

Пример. Клетки клинического штамма E.coli 164, резистентного к гентамицину,

0 тобрамицину, сизомицину, нетилмицину, и продуцирующего фермент ААС(3)-Па, выращивают в L-бульоне в течение ночи при 37°С. Из бактериальной суспензии изолируют ДНК R-плазмиды, имеющую мол.м. 70 Мд

5 и содержащую детерминанту резистентности к гентамицину, тобрамицину, сизомицину и нетилмицину. Выделенную ДНК гидролизуют эндонуклеазой рестрикции Hindlll и лигируют с ДНК векторной плазми0 ды pUC19, гидролизованной эндонуклеазой Hindlll. Смесью, содержащей лигированные молекулы, трансформируют реципиентный штамм E.coli JM101. Трансформанты, содержащие рекомбинантные плазмиды, от5 бирают на агаризованных средах, содержащих гентамицин в концентрации 10 мкг/мл, Отобранные трансформзнты рассевают до отдельных колоний на агари- зованной среде LB, содержащей 10 мкг/мл

0 гентамицина. Отдельную колонию выращивают в жидкой питательной среде LB в течение ночи и выделяют ДНК щелочным методом. Проводят в стандартных условиях гидролиз плазмидной ДНК эндонуклеазой

5 рестрикции Hindlll и в присутствии маркеров молекулярной массы устанавливают, что детерминанта резистентности к гентамицину, сизомицину, тобрамицину и нетил- мицину находится в составе Hindlll

0 фрагмента размером 2,3 т.п.н.

Таким образом, плазмида pSV11, полученная в результате встраивания Hindll фрагмента R- плазмиды клинического штамма Escherichia coli размером 2,3 т.п.н. в пол5 илинкер векторной плазмиды pUC19, содержит в своем составе ген резистентности к гентамицину, сизомицину, тобрамицину и нетилмицину.

При трансформации рекомбинантной

0 плазмидой реципиентного штамма E.coli К12 JM101, получают штамм, содержащий ген аасС2а и продуцирующий 3 аминоглико- зидацетилтрансферазу типа Па,

Штамм Escherichia coli, содержащий ре5 комбинантную плазмиду, культивируют в L- бульоне в течение ночи в присутствии гентамицина в концентрации 5 мкг/мл. Из 200 мл ростовой среды, когда концентрация клеток достигнет стационарной фазы, ще- лочным методом выделяют плазмидную

ДНК. При этом выделяется приблизительнорекомбинантную плазмиду с геном аасС2а,

50-80 мкг плазмидной ДНК со 100 мл бульо-можно сконструировать ДНК-зонд, специна. Проводят рестрикцию 10 мкг плазмид-фичный для гена аасС2а. Этот ДНК-зонд моной ДНКэндонуклеазой рестрикции EcoRVжет применяться для детекции

Фрагмент размером 537 п.н. вырезают из5 резистентных к гентамицину клинических

геля, проводят его электроэлюцию в диализ-штаммов, содержащих ген аасС2а, и вследный мешок, очищают двукратной экстра-ствие этого, наиболее рационального выбокцией фенолом, двукратным осаждениемра антибиотика при химиотерапии

этанолом. Радиоактивное мечение фраг-гнойно-септических и особо опасных инфекмента проводят реакцией ник-трансляции.10 ций.

Радиоактивно меченый фрагмент использу-Формула изобретения ют в качестве зонда в экспериментах по

ДНК-ДНК гибридизации.Штамм бактерий Escherichia coli

Таким образом при использовании пол-ВНИИА № 2075, содержащий рекомбинантученного нами штамма Escherichia coli кол-15 ную плазмидную ДНК pSV11, кодирующую

лекция ВНИИА N 2075, содержащего3 -аминогликозидацетилтрансферазу.

Использование: биотехнология, генетическая инженерия. Сущность изобретения: сконструирована рекомбинантная плазмид- ная ДНК pSV11, содержащая детерминанту с геном аасС2а. Данной плазмидой трансформируют штамм-реципиент E.coli K12JM101, получен рекомбинантный штамм, задепонирован в коллекции ВНИИА под номером 2С75. 1 табл.

1ч2(13 4о:иin ОSO90К1 ПО

i TTTSGTOC TCAGAATACC сптгбАзг сз тттт и хААСиСАА: чз:с:етАБЗ TAAATCTCCG AGCATFCAG ЕИАС-TGTCTG TGTGAGTTGA ATCTGAATGG

111САбТТййТАТ TTAG7%TC riaGGTC TntКЕнЗГЗгп С-СА5ьЈС6А СЗТСБГПт TC-3CAGSCGG ТТГАСААСг- G3riG6C-ACAA С АТТПСТС AACAC TT:3

121D3T3CTGGAA TCftTGGTTEC АТСАСБСАЗТIVA GACD3 AT AKGTAT ::GMASTT БЗчСПСЙЗС ATC BCTZAT ЗчАСЗСБАбТ 35T1AGTTTA CGCGCTGCftA

3 1ATTCriGCAAA AHCAUGGCTA AATGTCCC TСбГС-GGTAG ттттт чт-с СьСАААТТСЗ CCGCAftTCTA WCA4CTT CTA3GCSTTC AATCAAGCCC

41ZSTGTGGTGft CGATACCAAS TTCAuC 7TоЗААТААААЗ БСАСЧЕ:: Г;ЗСЗ:АЗ:3 (TCA3CAG6A GGICTTCCCA CAGChCACCC TATACCAAGG

Я1ATTCGATbTC ACTCCACTCG чбСАЗАССААTA,,TC-C3TIC CASC TTcHb ЗпТЗССОТ СГ АТ:66 CTGC6ACTAA nGCAnTMT OTATTc A i3GCTTGttArt

-:з ТТЗАСА-: ТЦ-АМ

bbi CCGTTGTTTG A5cftHA5GSC TTAATGTA5T KiTC, ТАГ;ТЗ Т ЗЗТ.ТТ:ЗТ TAWAGCTCA TTTTAACATC TA:fhC TTT TTCbA(-Ht.nT иПмяТТ: 771 6СТБТТТЙТЕ GA3TTTTGCA AGTGCCTCGA ТТТйЗнЗьнЗ ATbTtG:;-r ;CA A 5:33 PAG5CAATAA CGCAGGCGCT ТСмАьАнСТС GGhSTXAbA ССбЗТбгССТ

se; ATTGATGG G CATG::TCAC TTAMAG.L--, тззксзст: б.«ездзз-з :G3AGA:&ST сзтт&ссзсв TTACGCTCCG сбс-ттк-з:с ЗАСТЗСЗАСТ

991 ACGCrtTCGTG GSrtCCG TCA CCCTAC3AG3 „Wtb k cGCGC Cr- -т;5АТЗАСн A CCCGCCG TACCT33CCG C3GTTC3nTC ССЗСА-Сбл CC 3GnCTTA 1101 CGTGGGTTCG БССТьЛиАА ZT lhhXCC СЖССГЗХ- GZGCbGCGCG CACCCCGf-TG CATCG«TGGT 03CtGTTG6T ССАСТ&ЗСЛБ AnACGCTGbC

::n GGAGCCTCAC AA6CTCGGTC Acs:c 5:-i. з&АГйГСо ccuO :cj;: CGT-:; TCC CI TSSCGGG ч зссста: тьттззстзс T.

1321 САТТВСнСТА CGCCSfiRSCG йПССГЗА CZi.:- йА nC jSIjj T3 .ь:-1нТЗЈ,Зь Т6::6АТСС1 ТЗЗцййСААС GKCAAGKG .-t,-,AfC b3L TCL4AT TACGATTCAA W GuCAT CT CCrtTT3C l ьС - СЗАА5 CAnAJ-C .-L . ACTrtTASCAA н ЗСТГАССТ ZriAGC C-GT CCCCATCorti мпЗС-IGTCoT 1541 6GGCTTTGC CA51GCTACC TsrCV:3C ,-&: ЗТйнГГ иС ЗСЕт; ;С1А TCTT5A 3AAG CATTTCGGAA СЗАС ССБА CG GX bC САЗЗААбТСь CCGAGT63TC TTGCGA5CCT TCASGTTAGt jj C3A: r,rr:HTJA : Т36,Г.АА:3 З СЛТТЗб З CGCC-33AAAG АСЗчСК ьо СтлЗС.ЗС-Т1 ЗСоСбчТСоС 17Ы СЗТТССААнТ C3CTGATC T ЗпГСС1пн - .,;г -,3м -.13 ЗЗАЁ ЗЛяил tTn C™:tA I СС п -. ЗСипГТнпТС 1871 CAAflAACTGC CCAGAAAGT7 AhTAA 7A. nATlZ Tl.; LT ЗАЗ А Т „Af,AG3rif-:i ТСТААТьААТ АТТЛТ:А(-3 -пнмАТмййСА , СьА Ьинп Т&Ацб 1981 AAAThTTftCA ТчССРТ&ТА ССТС-ГТЗА i C Jrth-i T бАД,:.,: 5-,ЗТЗСт6тС АА оСиЗСА ТтАААчХтЗ СЗбЛЗиСпич 2091 GAAGGAGAAA ТТАПСААБь ьСААЗАГ - г- „tlfi-STTnb Т Ьи тугт АС нЗ«6АА IhACTC: ЗбА ААнТСл ТААСАТСААЗ АмАТАЗ ССА 2201 СААТТТСПА AA3TTCTAGT АбЮС,С .: -:Г тЗ Ј|Ат -гйц- ГТГСССА Ч CCCTGCTTTT VA