ДИНАТРИЕВАЯ СОЛЬ J -МЕЧЕНОГО АДЕНИЛИЛ(2` - 5`) АДЕНИЛИЛ(2` - 5`) АДЕНОЗИНТИРОЗИНА МЕТИЛОВОГО ЭФИРА В КАЧЕСТВЕ ЛИГАНДА ДЛЯ РАДИОИММУНОЛОГИЧЕСКОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ 2`,5`-ОЛИГОАДЕНИЛАТОВ Советский патент 1995 года по МПК C07H21/00 G01N33/60 

Изобретение относится к иммунологии, конкретно к динатриевой соли ¹²⁵J-меченого аденилил(2^l-5^l)аденилил (2^l-5^l)-аденозинтирозина метилового
эфира (I) формулы

где
Ade= которая может быть использована при радиоиммунологическом определении биологически активных 2^l, 5^l-олигоаденилатов в различных биологических образцах.

2^l, 5^l-Олигоаденилаты - природные низкомолекулярные биорегуляторы, являются медиаторами действия интерферона [1], присутствуют в различных органах и тканях, и в наномолярной концентрации обладают разнообразной биологической активностью [2]. Это свидетельствует о возможности использования 2^l, 5^l-олигоаденилатов в медицине в качестве лекарственных средств. Концентрация 2^l, 5^l-олигоаденилатов в клетках зависит от гормонального статуса организма и уровня циклических нуклеотидов, что позволяет использовать определение уровня 2^l,5^l-олигоаденилатов в качестве средства микроанализа для диагностики вирусных, аллергических, аутоиммунных и других заболеваний.

Одним из важных элементов наиболее распространенного в практике радиоиммунологического метода микроанализа является радиоактивномеченый лиганд. Для радиоиммунологического определения 5^l-дефосфорилированных 2^l, 5^l-олигоаденилатов в качестве меченных лигандов используют ¹⁴С-меченый аденилил (2^l-5^l) аденилил (2^l-5^l) аденозин [3] и ³²p-меченый аденилил(2^l-5^l)аденилил(2^l-5^l)аденилил (3^l-³²p-5^l)цитидилил-3^l-фосфат [4] . Недостатками этих лигандов являются низкая активность и сравнительно малый период полураспада изотопов соответственно, а также необходимость использования ферментов для их получения.

Наиболее близким по строению к заявляемому является ¹²⁵J-меченый аденилил (2^l-5^l)аденозин-2^l(3^l)-О-сукцинилтирозин метиловый эфир [5].

Недостатком этого лиганда является наличие сложноэфирной связи между димером и остатком янтарной кислоты, что приводит к нестабильности лиганда в водных растворах. Ранее, на примерах 2^l-O-сукцината аденозин-3^l, 5^l-циклофосфата и его конъюгата с белком было показано, что сложноэфирная связь лабильна в водных растворах даже при -20^оС [6], что приводит к снижению иммуногенности конъюгата.

Целью изобретения является новый ¹²⁵J-меченый лиганд для радиоиммунологического определения 2^l,5^l-олигоаденилатов, более стабильный, чем описанные в литературе.

Поставленная цель достигается соединением I, которое получают обработкой дитриэтиламмониевой соли аденилил (2^l-5^l)аденилил (2^l-5^l)аденозинтирозина метилового эфира (II)Na¹²⁵J в присутствии хлорамина Т и выделением целевого продукта известными методами.

П р и м е р 1. Динатриевая соль ¹²⁵J-меченого аденилил (2^l-5^l)аденилил(2^l-5^l)аденозинтирозин метилового эфира (I).

В ампулу, содержащую 10 мкл 0,1 М натрийфосфатного буфера (НФБ) с pH 7,5, добавляют последовательно раствор 1,5 мкг (1,0 нмоль) аденилил (2^l-5^l)аденилил(2^l-5^l)аденозинтирозина метилового эфира дитриэтиламмониевой
соли (II) в 5 мкл НФБ, 100 МБк Na¹²⁵J в 6 мкл 0,1 н.раствора NaOH и раствор 20 мкг хлорамина Т в 10 мкл НФБ. Смесь перемешивают при комнатной температуре 15 мин, добавляют к ней раствор 20 мкг натрийметабисульфита в 10 мкл НФБ и хроматографируют на колонке (1х25 см) с TSK-гелем HW-40. Продукты элюируют раствором НФБ, содержащим 0,1% бычьего сывороточного альбумина со скоростью 6 мл/ч. Фракции, содержащие ¹²⁵J-меченое производное I объединяют и лиофилизируют. Получают 72,6 МБк (72,6%) соединения I с радиохимической чистотой 95-98% и удельной активностью 186 Ки/ммоль.

Целевой ¹²⁵J-меченый лиганд I обладает высокой удельной активностью и радиохимической чистотой, синтезируется с высоким выходом и сохраняет способность связываться с антителами после 2 мес. хранения при -20^оС в виде замороженного раствора. Связывание полученного лиганда с антителами, специфичными к 2^l, 5^l-олигоаденилатам, составляет 95±3%.

Описываемый ¹²⁵J-меченый лиганд I используют в радиоиммунологическом определении 2^l, 5^l-олигоаденилатов в биологических средах.

П р и м е р 2. Использование ¹²⁵J-меченого лиганда в радиоиммунологическом определении аденилил (2^l-5^l)аденилил (2^l-5^l)аденозина(2,5-A₃) в плазме крови донора.

В пробирки первой серии в дубликатах вносят по 0,05 мл калибровочных проб раствора аденилил (2^l-5^l)аденилил(2^l-5^l)аденозина, приготовленных на лиофилизованной плазме с добавлением 0,005 М ЭДТА. В пробирки другой серии вносят по 0,05 мл плазмы крови доноров, взятой с ЭДТА. В каждую пробирку вносят по 0,1 мл раствора ¹²⁵J-меченного аденилил(2^l-5^l)аденилил(2^l-5^l)аденозинаметилового эфира тирозина в 0,05 М ацетатцитратном буфере (pH 6,2-6,3) 18100-18000 распадов в минуту на 1 пробу) и 0,1 мл антисыворотки в том же буфере в разведении 1:6000. Пробы инкубируют 4 ч при 4^оС, добавляют по 1 мл раствора систем для разделения, представляющего 10% -ный раствор полиэтиленгликоля с мол.м. 6000, содержащего 0,9% ЭДТА и 0,002 мл разведенных 1:500 вторых антител (бараньи антитела к иммуноглобулинам кролика). Пробы встряхивают, центрифугируют при 300 об/мин в течение 15 мин, раствор декантируют, осадок радиометрируют на счетчике. Для каждой пробы определяют величину В/В_о (см. таблицу). На основании полученных данных строят калибровочную прямую в logit-log координатах (ось ординат logit B/B_o-ln_e(), ось абсцисс - log концентрации стандартных растворов). Для раствора анализируемых проб по данным счета определяют концентрацию аденилил(2^l-5^l)аденилил (2^l-5^l) аденозина (см.таблицу).

Изобретение относится к ¹²⁵J -меченым лигандам класса нуклеиновых кислот, в частности ¹²⁵J -меченому аденилил (2′-5′) аденилил (2′-5′) аденозинтирозин метиловому эфиру формулы (cм.рисунок), где который может быть использован при радиоиммунологическом определении биологически активных (2′-5′) -олигоаденилатов в разных биологических объектах. Цель - поиск более стабильного в процессе определения лиганда. Синтез ведут обработкой ди(триэтиламмониевой) соли аденилил (2′-5′) аденилил (2′-5′) аденозинтирозина метилового эфира в присутствии хлорамина Т и натрийфосфатного буфера, pH 7,5. Выход 72,6%, радиохимическая чистота 95 - 98%, удельная активность 186 Ки/ммоль. Лиганд обладает способностью связываться с антителами после 2 мес. хранения при -20°С. Связывание с антителами, специфичными к (2′-5′) -олигоаденилатами, составляет 9,5 - 3%. 1 табл.

ДИНАТРИЕВАЯ СОЛЬ ¹²⁵J -МЕЧЕНОГО АДЕНИЛИЛ(2' - 5') АДЕНИЛИЛ(2' - 5') АДЕНОЗИНТИРОЗИНА МЕТИЛОВОГО ЭФИРА В КАЧЕСТВЕ ЛИГАНДА ДЛЯ РАДИОИММУНОЛОГИЧЕСКОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ 2',5'-ОЛИГОАДЕНИЛАТОВ.

Динатриевая соль ¹²⁵J - меченого аденилил (2'-5')аденилил(2'-5')аденозинтирозина метилового эфира формулы

где

в качестве лиганда для радиоиммунологического определения 2',5'-олигоаденилатов.