9B-ОКСИ-2-ФЕНИЛАМИНО-1,3,4-ТИАДИАЗИНО (5,6-B) ИНДОЛ, ПОВЫШАЮЩИЙ ФИЗИЧЕСКУЮ ВЫНОСЛИВОСТЬ У НЕАДАПТИРОВАННЫХ К ВЫСОТЕ ЖИВОТНЫХ Советский патент 1996 года по МПК C07D513/04 A61K31/54 

Настоящее изобретение относится к новому химическому соединению, конкретно к 9b-окси-2-фениламино-1,3,4-тиадиазино[5,6-b]индолу, формулы I

Соединение I (лабораторный шифр АТ-359) является биологически активным соединением и может быть использовано в качестве средства, повышающего физическую выносливость у неадаптированных к высоте (гипоксии) животных.

Из литературы известно, что с целью профилактики гипоксической гипоксии, развивающейся на высоте (высотная или горная болезнь), предлагалось множество средств, в той или иной степени повышающих резистентность организма к пониженному парциальному давлению кислорода. Наибольшее признание получили хлористый аммоний, аскорбиновая кислота с различного рода кислыми добавками в сахарном сиропе, и, наконец, гутимин и его соли [1]
В возникновении горной болезни, кроме недостатка кислорода, играют роль и другие факторы, среди которых одним из наиболее серьезных считается физическое утомление, особенно при восхождении на высоту пешком. Симптомы горной болезни могут проявляться даже у людей, акклиматизированных к высоте (ступенчатая подготовка, например, у альпинистов). Вместе с тем иногда возникает необходимость срочного подъема на высоту у лиц, неадаптированных к ней и тогда можно предположить, что у данного контингента практически в 100% случаев будет наблюдаться развитие горной болезни.

Целью настоящего изобретения является расширение ассортимента соединений, которые при малой токсичности обеспечивали бы повышение физической выносливости у абсолютно неадаптированных к высоте животных.

Поставленная цель достигается 9b-окси-2-фениламино-1,3,4-тиадиазино[5,6-b]индолом, формулы I.

Данное соединение представляет собой порошок зеленовато-желтого или оранжево-желтого цвета, т. пл. от 212 до 229^oC; после перекристаллизации из смеси диметилформамида с ацетонитрилом (1,2:1 по объему) желтые ватообразные игольчатые кристаллы, т. пл. 249^oC. Вещество на холоде растворимо в ацетоне и диметилсульфоксиде, умеренно в пиридине при нагревании, не раствоpимо в воде, трудно растворимо в спирте, умеренное в бутиловом спирте, легко растворимо в диметилформамиде, кристаллизуется из ледяной уксусной кислоты.

Вещество однородно по данным тонкослойной хроматографии. Для его очистки достаточна двухкратная перекристаллизация.

Условия тонкослойной хроматографии. Вещество наносят на нейтральную окись алюминия для хроматографии по Брокману II степени активности (Реанал, Венгрия) в виде раствора в ацетоне и хроматографируют в хлороформе, содержащем 4% метилового спирта по объему Rf 0,52, а также в системе бензолметиловый спирт, 10:1, Rf 0,32.

Вещество как в видимом, так и в УФ- свете не содержит примесей, в том числе исходного 2(4-фенил)-тиосемикарбазона изатина.

УФ-спектр: λ_макс. нм (lg E) 244 (4,244), 262 (4,169), 362 (4,003), 419 (4,051) УФ-спектр измерен для 3,64•10^-5М. раствора в спирте содержащем 0,16% диметилсульфоксида по объему, на приборе СФ-8. Положение длинноволновой полосы поглощения характерно для производных 1,3,4-тиадиазино[5,6-b]индола.

ИК-спектр, ν см^-1: 660, 690 (сл.), 695, 748 (оч. с.), 772, 812 855 (сл.) 873, 902 (с.), 959 (сл.), 1030 (сл.), 1110 (плечо), 1132 (оч. с.), 1160 (с. ), 1218 (с. ), 1259 (оч. с.), 1306, 1330, 1350 (см.), 1436 (оч. с.), 1450 (оч. с.), 1496 (оч. с.), 1513 (с.), 1569 (оч. с.), 1600 (с.), 1618 (оч. с.), 2750, 2790, 2880, 3000 (плечо), 3300, 3400.

В ИК-спектре отсутствует полоса карбонила в области 1600-1800 см² и содержатся характерные для тиадиазиноиндолов частоты ассоциированной гидроксильной группы (3280 см^-1), NН индольного кольца (3400 см^-1) и связи C=N (1618 см^-1). ИК-спектр снят в таблетке KBr на приборе ИКС/22.

Спектр ПМР в диметилсульфоксиде, t м.д. NH^- 0,99 (с. 1Н), Ar-H 1,14, 1,28 (д. 1Н), ArH,H 2,22-3,50 (м. 8Н). Спектр снят на приборе Perkin Elmer R-12, рабочая частота 60 МГц.

Названное соединение получают путем циклизации 2(4-фенил)-тиосемикарбазона изатина при обработке концентрированной соляной кислотой по приведенной ниже схеме:

Реакцию проводят при комнатной температуре. Выход сырого продукта 86-91% после очистки 57-62% Строение продукта реакции подтверждается данными элементного анализа, а также ИК-, УФ- и ПМР-спектров.

Найдено, С 60,61, 60,56; Н 4,19, 4,22; N 18,77, 18,65; S 10,94, 10,89.

C₁₅H₁₂N₄OS.

Вычислено, С 60,80; Н 4,05; N 18,96; S 10,80.

П р и м е р 1. 22 г (0,074 мол) тонкоизмельченного 2(6-фенил)тиосемикарбазона изатина перемешивают с 165 мл концентрированной соляной кислоты в течение 5 ч. Оставляют на 2 суток, затем фильтруют, осадок отжимают и переносят в стакан с 170 мл ледяной воды. При перемешивании добавляют бикарбонат натрия до нейтральной реакции (расходуется около 15 г (0,18 мол). Фильтруют, осадок промывают водой (3х50 мл) и сушат при 100^oC. Получают 20 г вещества, выход 91% после кристаллизации из смеси диметилформамида с ацетонитрилом желтые кристаллы, т. пл. 249^oC.

П р и м е р 2. 13 г (0,044 мол) тонкоизмельченного 2(4-фенил)тиосемикарбазона изатина встряхивают со 100 мл концентрированной соляной кислотой в течение 5 ч, оставляют на 18 ч и снова встряхивают в течение 3 ч, обрабатывают как в примере 1. Получают 11,2 г вещества, выход 86,5% после перекристаллизации из смеси диметилформамида с ацетонитрилом - желтые кристаллы, т. пл. 349^oC.

1. Определение токсичности препарата АТ-359.

Острая токсичность соединения определялась на мышах при внутрибрюшинном (в/б) введении и крысах при пероральном введении. Животные наблюдались в течение трех суток. Статистическая обработка полученных данных производилась по методу Веренса-Шлоссера.

Найдено, что ЛД₅₀ у мышей составляет 3811 мг/кг, у крыс 4346 мг/кг, т.е. использовавшаяся в опытах на "высоте" найденная оптимальная доза составляет для крыс 25 мг/кг и равна 1/179 от ЛД₅₀ что намного превосходит принятые параметры фармакологической широты действия препаратов, использующихся в клинической практике.

2. Определение специфического эффекта препарата АТ-359.

1.2. Первичный скрининг проводился на мышах с целью определения влияния препарата на физическую выносливость животных.

Регистрировалась продолжительность плавания мышей в контроле (физ. р-р) и в опыте (на фоне АТ-359, введенного за час до плавания в дозах 10, 20 и 40 мг/кг). Температура воды в бассейне поддерживалась на уровне 25-26^oС. Животные плавали с грузом, равным 5% массы тела, одновременно в опыте использовалось 20 мышей. Опыты повторены 3 раза. Препарат вводился внутрибрюшинно.

Было обнаружено, что предварительное введение изучаемого вещества вызывает удлинение длительности плавания мышей, достоверное при введении дозы 20 мг/кг.

контроль 100%
10 мг/кг 136% p ≅ 0,2
20 мг/кг 237% p ≅ 0,05
40 мг/кг 191% p≅ 0,1.

В следующей серии опытов исследовалось влияние АТ-359 на длительность повторного плавания мышей с целью выяснения влияния АТ-359 на восстановительные процессы. Животным предварительно давалась стандартная нагрузка (плавание с грузом, равным 5% массы тела в течение 10 мин при температуре воды в бассейне 26-28^oC), после которой немедленно вводился в/бр препарат в дозах 10, 20 и 40 мг/кг и через 50 мин мыши совершали повторное плавание. Выявлено, что введение препарата АТ-359 после начальной дозированной нагрузки, вызывает увеличение продолжительности повторного предельного плавания, соответственно дозам:
10 мг/кг 206% p ≅ 0,05
20 мг/кг 298% p ≅ 0,01
40 мг/кг 246% p ≅ 0,05
Контроль 100%
Предварительные опыты на мышах (первичный скрининг), показали, что препарат АТ-359 вызывает значительный прирост длительности плавания. Этот вывод послужил основной для проведения опытов на крысах, выполнявших бег на третбане.

2.2. Определение влияния АТ-359 на физическую выносливость крыс.

2.2.1. Профилактическое введение АТ-359.

Препарат вводился внутрибрюшинно в дозах 15 и 30 мг/кг, однократно. Схема опыта. Крысы выполняли бег на третбане (скорость ленты 42-45 м/мин) до отказа, т. е. до отказа выполнять бег, несмотря на электростимуляцию. В течение трех суток животные отдыхали, затем им вводился препарат и они вновь совершали бег на третбане через разные промежутки времени: 1, 2, 4, 6, 24 и 48 часов после введения АТ-359. Параллельно регистрировалось время пробега контрольных крыс, которым вводился физиологический раствор. Сравнивалась продолжительность времени пробега до и на фоне введения препарата, а также продолжительность времени пробега контрольных крыс. Было выяснено, что при введении 15 мг/кг продолжительность пробега опытных крыс составляет по отношению ко времени первого пробега, принятого за 100% через
1 ч 157,44% p ≅ 0,25
2 189,41% p ≅ 0,05
4 103,97% p ≅ 0,9
6 117,4% ≅ 0,7
24 252,49% p ≅ 0,001
48 131,25% p ≅ 0,5
При введении 30 мг/кг
через
1 ч 168,9% p ≅ 0,1
2 205% p ≅ 0,2
4 156,1% p ≅ 0,4
6 107,8% p ≅ 0,9
24 274,3% p ≅ 0,02
48 225,4% p ≅ 0,05
У контрольных животных время пробега после введения физиологического раствора составляло по отношению ко времени первого пробега (100%) через исследованные промежутки времени 92-101%
2.2.2. Определения влияния на процессы восстановления.

Схема опыта. Предварительно отобранные крысы совершали бег на третбане до отказа, после чего им сразу же вводили АТ-359 в/бр в дозе 30 мг/кг. Другой группе крыс вводился физиологический раствор. Обе группы животных совершали вновь бег до отказа через 1, 2, 4, 6, 24 часа.

В контрольной группе восстановление физической выносливости через 1, 2, 4, 6 часов составляло 35-50% через 24-48 часов 90-100%
На фоне введения препарата АТ-359
через
1 ч 68,61%
2 60,39%
4 54,54%
6 29,28%
24 133,33% p ≅ 0,1
48 157,4% p ≅ 0,05
Таким образом, проведенные исследования показали, что препарат АТ-359, обладает способностью повышать физическую выносливость и ускорять процессы восстановления у лабораторных животных при нормальном парциальном давлении кислорода. Это послужило основанием для введения АТ-359 животным, абсолютно неадаптированным к высоте с целью выяснения его влияния на их физическую выносливость.

2.3. Определение специфического эффекта препарата АТ-359
Методика. Опыты выполнены на 120 белых крысах-самцах Рапполовского питомника, массой 160-180 г, содержащихся в одинаковых условиях существования. Данные животные были отобраны из 200 крыс, поступивших в одно время из питомника. Отбор происходил по тесту обучения бегу на третбане. Обучение происходило в течение трех суток. В дальнейшем было сформировано четыре равноценных группы (по 30 животных в каждой). За 12 ч до начала эксперимента кормление животных прекращалось. Исследуемые препараты (АТ-359, аскорбиновая кислота, гутимин и физиологический раствор-контроль) вводились внутрибрюшинно за 45-60 минут до выполнения бега на "высоте". Подъем животных на "высоту" осуществлялся с таким расчетом, чтобы не успела развиться адаптация к недостатку кислорода. Скорость подъема составляла 20 м/сек. Подъем осуществлялся до "высоты" 5000 м. После достижения заданной высоты включалась лента третбана, а на "ударную площадку" подавался электрический ток, напряжением 25 В. В барокамере использовался четырехдорожечный третбан, что давало возможность одновременно использовать в опыте представителя от каждой группы. Эффективность исследуемых препаратов оценивалась по длительности бега на третбане, концом которого (бега) считалось принятие животным бокового положения.

Следовательно, 9b-окси-2-фениламино-1,3,4-тиадиазино[5,6-b] индол обладает выраженной биологической активностью и статистически значимо (р ≅ 0,001) повышает физическую выносливость животных, неадаптированных к высоте (гипоксии), превосходя в этом отношении гутимин и аскорбиновую кислоту.

Вещество обладает низкой токсичностью и достаточной фармакологической широтой.

9в-Окси-2-фениламино-1,3,4-тиадиазино (5,6-в)индол формулы: повышающий физическую выносливость у неадаптированных к высоте животных.

9в-Окси-2-фениламино-1,3,4-тиадиазино (5,6-в)индол формулы:

повышающий физическую выносливость у неадаптированных к высоте животных.