Способ получения антибиотика сс-1065 Советский патент 1981 года по МПК C12P1/06 C12R1/465 

(54). СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИБИОТИКА СС-1065 галактозе, глюкозе, маннозе, мальто целлобиозе, декстрине, растворимом крахмале, глицерине, маннкге и инозите. Слабо растет на арабинозе, ок лате натрия, ацетате натрия и сукци нате натрия. Плохо - на рамнозе, са харозе, лактозе, рацинозе, инулине, дульците, сорбите, салицине, феноле цитрате натрия, формиате натрия, та рате натрия и салицилате натрия. Культура слабо растет при , умеренно при 18, 24 и хорошо растет при 28, 32 и 37°С. При 55°С роста не наблюдается. Предложенный антибиотик получают путем выращивания организма в водно питательной среде в погруженных аэробных условиях. Для вьоращивания мо использовать поверхностные культуры и колбы-бутыли. Организм выращивают в питательной среде, содержащий источник углерода, например ассимилирующийся углеводород, и источник аз та, например ассимилирующееся соеди нение азота или белковое вещество. К предпочтительным углеродным источ никам относятся глюкоза, желтый сах сахароза, глицерин, крахмал, кукурузный крахмал, лактоза, декстрин, черньае патоки и т.п. К предпочтител ным источникам азота относятся жидкость от отстоя кукурузы, дрожжи, автолизовднные пивные дрожжи с твер дыми молочнйми продуктами, соевую муку, муку семян хлопчатника, кукурузную мукуf твердые молочные продукты, панкреатический продукт пищеварения казеина, рыбную муку, твер дые продукты от перегонки, животные пептоновые жидкости, мелкие мясные и костные остатки и т.п. Микроколичества металлов, как цинк, магний, марганец; кобальт, железо и т.п., добавлять в ферментационную среду не нужно,поскольку перед стерилизацией поелейней в качеству компонен тов применяют водопрподную воду и неочиценные ингредиенты. Выращивание осуществляют при любой температуре, обеспечивающей удов летворительный рост ми1кроорганиэма, например в диапазоне примерно 1840°С, предпочтительно примерно 2028°С. Обыкновенно оптимального количества антибиотик достигает в течение примерно через 3-15 дней. Среда обычно остается в течение ферментационного процесса щелочной. Конечный рН зависит частично от присутствующе го буфера,если таковой применяется, и частично от начального рН культуральной среды. Если выращивание производят в больших сосудах или баках, целесообразно применять вегетативную, а не споровую форму микроорганизма при :инокуляции во избежание заметной за держки при производстве антибиотика и связанного с этим неэффективного использования оборудования. Желательно получение вегетативного прививочного материала в питательной бульонной культуре путем инокуляции этой . бульонной культуры .аликвотным количеством почвы, жидкой W-агаровой среды или же разводкой на косой среде. По обеспечении такого молодого активного вегетативного прививочного материала его стерильно - помещают в большие сосуды или баки. При выделении и очистке антибиотика, получаемого предлагаемым способом из,ферментационного пива, может найти применение целый ряд способов. Вьщеление осуществляют экстрагированием с,, помощью растворителей, как хлористый метилен, ацетон, бутанол, этилацетат и T.n.j для очистки сырых препаратов антибиотика применяют хроматографию на силикагеле. Согласно предпочтительному варианту процесса выделения антибиотик выделяют из культуральной среды разделением мицелия и нерастйоренного твердого продукта обычными способами, например фильтрацией или центрифугированием и экстракцией растворителем мицелкевого жмыха иставшего прозрачным бульона. Мицелиевый экстрагируют ацетоном, а экстракт выпаривают при пониженном давлении до водного концентрата. Водный концентрат добавляют в фильтрованный бульон, который затем трижды экстрагируют половиной объема хлористого метилена, Соединенные экстракты выпаривают при пониженном давлении, полученное масло разбавляют скеллизольвом в(изомерные гексаны). Полученную взвесь охлаждают в течение ночи, после чего собирают твердый продукт, промывают скеллизольвом В и сушат,получая относительно сырой препарат(желто-коричневый твердый продукт) антибиотика СС-1065. Полученный сырой препарат антибиотика подвергают очистке, получая существенно чистый кристаллический препарат антибиотика СС-1065. Первой очистной ступенью является экстракция сырого прэпарата антибиотика СС-1065 ацетоном. После выпарки ацетона полученный остаток растирают с метанолом, получая кристаллический препарат антибиотика СС-1065. Эти кристаллы можно промыть холодным метанолом с целью повышения степени их чистоты. Дальнейшую очистку антибиотика СС-1065 осуществляют путем хроматографии на силикагеле с кристаллизацией активных фракций. Препарат антибиотика СС-1065 целевой степени чистоты получают перекристаллизацией вышеприведенного антибиотика СС-1065препарата из ацетона метанола. Активные фракции от хроматогра- , фии на силикагеле определяют тонкослойной хроматогр)афиеи-биоавтографией

Согласно этому способу 1 мк образцапробы антибиотика помещают в виде капли на силикагель Baker flex silic gel IB-F и биоавтографируют на орга низме Bacillus subtil is (синтетическая среда)или же Sarcina lutea после проявления в растворе, состоящем из 90 ч хлороформа, 10 ч метанола и 0,5 концентрированной гидроокиси аммония ТСХ-зона антибиотика СС-1065 от 1мк или более высоких количеств кристаллического образца-пробы также можно визуализировать с помощью УФ-света (254 нм) в виде зоны янтарного света при обвдчном свете.

Пример. Ферментация. Для инокуляции крлб Эрленмейера емкостью в 500 мл со 100 мл стерильной среды, содержащей вес.%: Экстракт дрожжевой . О,3 Бакто-триптон0,5

Декстрин0,1

используют штамм Streptococcus 2e1ensis NRRh 11,183.

Эту среду инкубируют при в течение 48 ч на ротационном вибраторе типа Gunp rotaru shaker при 250 об./мин.

Прививочный материал применяют дл инокуляции колб Эрленмейера емкостью 500 мл для ферментации, со 100 мл стерчльной ферментационной средаа, содержащей вес.%:

Черная патока 1 Декстрин 1

Бакто-триптон 1 , CaCOj0,5

Хлористый натрий 0,2. Значение рН-7,2. Ферментационньта колбы инокулируют при концентрации 5 МП прививочного материала на 100мл ферментационной среды. Колбы инкубируют 120 ч при 28°С на ротационном вибраторе типа ВАРИАН при 250 об/мин Испытание антибиотика СС-1065 завершается экстракцией исчерпанной питательной среды с применением двух объемов хлористого метилена. Разные количества метиленхлоридного экстракта (20, 10, 5, 2 и 1 мкл)наносят на полиграммные силикагельные листы типа Polygram Sil - N-HR и биоавтографи- руют на Sarcina lutea после проявления в системе растворителей, содержащих, мл:

Метиловый спирт10

Хлороформ90

Гидроокись аммония 0,5 для этого 125 мл охлаиаденного до 48°С агара инокулируют оттаянной бульонной культурой Sarcina lutea (0,5 мл/л), выливая затем в пластмассовые сосуды и давая отвердитель. Агаровые сосуды инкубируют при 32 С в течение 20-24 ч.

Прививочный материал Sarcina lutea, содержащий 10 клеток/мл хранят в качестве .аликвоты в газовой фазе жидкого азота.

Выделение антибиотика. Получеяный ферментационный бульок от 4-ферментационных процессов в баках по 10 л каждый фильтруют через слой Gel а ton FW 40 (диатомовая земля ). Мицелиевый жмых экстрагируют ацетоном экстракт выпаривают под пониженным давлением. В прозрачный бульон добавляют водный концентрат,полученный выше, затем трижды экстрагируют половиной объема хлористого метилена. НвтиOленхлоридные экстракты выпаривают под пониженным давлением до масла, которое разбавляют скеллизольвом В (1,5 л), после чего полученную взвесь охлаждают в течение ночи. Затем твер5дый продукт собирают, промывают скеллизольвом В и сушат, получая сравнительно сырой препарат анфибиотика СС-1065 в виде желто-коричневого твердого продукта. Этот сырой пре0парат можно подвергнуть биоиспытанию тонкослойной хроматографией-биоавтографией, как описано выше.

Очистка. Оарой препарат антибиотика СС-1065 экстрагируют ацетоном (400-800 мл) в целях удаления не5больших количеств нерастворимых в ацет.оне продуктов. Ацетон выпаривают , остаток растирают с метанолом (10 мл/мг). Взвесь охлавдают в течение ночи, полученный твердый крис0таллический продукт собирают, промывают холодным метанолом и сушат, выход 40-180 мг кристаллического препарата антибиотика СС-1065. Этот кристаллический препарат подвергают

5 биоиспытанию путем ТСХ-биоавтографии на силикагеле.

Дальнейшую очистку осуществляют . хроматографией на силикагеле и кристаллизацией активных фракций. Так,

0 например, 470 мг этого кристаллического твердого продукта растворяют в 940 мл ацетона и выпаривают на 10 мл силикагеля Geduran TMS160.

Полученный порошок хроматографируют на 100 мл силикагеля, элюируя

5 растворителем, состоящим из 80 ч хлороформа, 20 ч метанола и 4 . гидроокиси аммония. 20 фракций (по 20 мл каждая) собиргиот и выпаривают досуха. Фракции затем подвергают биоиспыта0нию посредством ТСХ-биоавтографии. Фракции 6-19 помещают в емкость и растирают с метанолом, получая 218мг высококачественного кристаллического антибиотика СС-1065. Целевой степени

5 чистоты можно достичь перекристаллизацией из ацетона-метанола, получая 167 г (77%) в основном чистых кристаллов антибиотика СС-1065.

Молекулярный вес антибиотика СС-1065 приблизительно 700, элемен0тный анализ С 61,06; Н 4,92,N 13Д7.

УФ-спектр поглощения. Раствор антибиотика СС-1065В.диоксане показывает сильное концевое поглощение с плечами при 230. нм(способнссть пог5

лощения ,00) и 258 нм(,10 и максимум при 364 нм(,10) .

ИК-спектр поглощения. Антибиотик СС-1бб5 показывает характерный ИКспектр поглощения в пасте на основе минерального масла в диапазоне волн 3800-600 (см.

Пики наблюдаются при следующих диапазонах вола, 2960, 2920, 2850, 1465 и 1377 , частично они зависят от алифатических С-Н колебаний минерального масла.

Растворимость. Антибиотик СС-1065 растворим в таких, растворителях, как диметил-сульфоксид(дмсф диметилформамид, ацетон, хлористый метилен, этилацетат, дйоксан и хлороформ.

с-ЯМР-спектр антибиотика СС-1065 при 20 МГц найден на спектрометре Varlan CFT-20 в растворе (около 1,0м71 около 75 мг/мп)образца-пробы антибиотика СС-1065 в дейтеро-диметилсульфоксиде. Спектр калибруют против центральной линии d6 ДМСО, помеченной 39/6 Ч/МЯ1 (частей на миллион в пересчете на тетраметилсилан, принимаемый за О ч/мл. Частоты регистрируют вниз от тетраметилсилана.

Протонно-магиитный резонансный спектр(н-ЯМР антибиотика CC-1065 при 100 МГц наблюдают на спектрометре типа Vartan XL 100-15 в растворе (около 0,5 МП, около 150 мг/мл образца-пробы антибиотика СС-1065 в

дейтеро-диметилсульфоксиде (d6 ДМСО). Спектр калибруют против внутреннего тетраметилсилана, частоты регистрируют в ч/MJiH. вниз от тетраметилсилана

Противомикробный спектр антибиотика СС-1065. Антибиотик СС-1065 действует против различных грамм-положительных и грамм-отрицательных бактерий и грибов, как видно из таблицы.

Опыты проводят следующим образом.

Минимальную ингибируккдую концентрацию (мик) определяют стандартными бактерицидными способами с применением двукратно разбавленных растворов антибиотика в бульоне Brain Heart.

Прививаемые организмы - полученные за ночь культуры испытуемых организмов, разбавленных таким образом, чтобы конечная популяция содержала приблизительно 10 клеток/мл. Трубки инкубируют на 42 ч при 28-37°С. МИК определяют переносом О,1 мл бульона из тех трубок, которые не показывают развития в 10 мл не содержащего антибиотика бульона, трубки, в которых за 24 ч не наблюдается роста культуры рассматриваются как содержащие бактерицидные концентрации. Бульон для грибов содержит,%:

0,5

3,0 Декстроза Дрожжевой

0,7, экстракт

Грамм-положительные бактерии Staphylococcus aureus UC 76 Staphylococcus aureus UC 552 Staphilococcusi aureus UC 70 Staphylococcus aureus UC 3665 Baci1lus sHbtilis UC 564 Streptococcus pyogenes UC 6055 Sarclna lutea UC 130 Streptococcus faecal is UC 157 Streptococcus faeca)is UC 3235

Грамм-отрицательные бактерии Escherichia col i UC 57

Proteus vulgaris UC 93

Pseubomonas aerugJnosa UC 95 Pseubomonas mildenbergii UC 3029

Salmonella gallinarum UC 265

0,0015

0,003

0,0015

0,003

0,025

0,0008

0,012

0,012

0,003

0,32

0,08

0,08 0,3

2,5

Klebsiella pneumoniae UC 57 Salmonella schottmue11eri UC 126 Salmonella pullorum UC 267

Fung i г

Candida albicans UC 1392 Saccharomyces cerenisiae UC 1337 Saccharomyces pastorianus UC 1342 PeniciIlium oxalicum UC 1268 Антибиотик CC-1065 также оказывает действие против опухолевых клеток L 1210, развивающихся в культуре (в пробирке). На живом организме мышей антибиотик СС-1065 также ингибирует лейкемию L1210, лейкемию Р 388 и меланому В 16. Антибиотик СС-1065 оказывает действие против грамм-положительных бак терий, например против Proteus vulga г i s, и тем самым может найти применение в качестве маслоконсервирующего .средства в целях ингибирования де ствия этой бактерии, вызывающей порч масла(растительного. Он также полезен в промывных растворах в области санитарии. Поскольку антибиотик СС-1065 оказывает действие против Bacillus subtilis его можно применят для обработки мест размножения тутового шелкопряда в целях предупрежде:ния или же минимализации заражений.

Продолжение таблицы .. „

0,8 0,3 0,08

0,3 0,04 0,3 0,2 вызываемых, как известно, этой бактерией. Предложенный способ позволяет получить новый антибиотик, который найдет применение в народном хозяйстве. Формула изобретения Способ получения антибиотика, о тлич.ающийся тем, что Streptomyces zelensis 11,183 выращивают в питательной среде, содержащей источники углерода и азота, в аэробных условиях, отделяют мицелий от культуральной жидкости, далее мицелий экстрагируют ацетоном, полученный экстракт концентрируют, объединяют о отделенной культуральной жидкостью и полученную смесь многократно экстрагируют хлористым метиленом.