Способ получения оптически активных производных (+)-бицикло (3.3.0)-октанола Советский патент 1993 года по МПК C12P41/00 C12P41/00 C12R1/84 C12R1/85 C12R1/865 C12P7/12 

где Ri, R2, Рз и R4 имеют вышеуказанные значения,

ферментативно или микробиологически подвергают стереоспецифическому ацилат- ному гидролизу и образовавшееся (+)-про- изводное бицикло (З.З.О)-октанола (+)- отделяют от неомыленного бицикло (3.3.0)- октанолацилата формулы (-)- или неомы- ленный энантиомер (+)-П отделяют от смыленного производного бицикло (3.3.0)- октанола (-)- и затем подвергают химическому ацилатному гидролизу (гидролизу ацилатной группы).

Если X обозначает линейный или разветвленный алкильный остаток с 1-7 С-ато- мами, то подразумевают следующие остатки: .-

(СН2)п - с п 1-7 (метилен, этилен, три-, тетра-пента, -гекса- и гептаметилен),

-С(СН3)2-. -СН(СНз)-, -СН(СНз)-СН2-,

-С(СНз)2-, СН2-. -СН2-СН(СН)з-, -СН2- С(СН3)2, . -СН2-СН(СНз)-СН2- -СН2- С (СНз)2-СН2-, СН-(С2Н5)-, -С(С2Н5)-,

-CH(C2Hs)-CH2-, -CH2-CH(C2Hs)-,

-СН2-С(С2Н5)2-, -СН2-СН(С2Н5)-СН2-,

-СН2-С(С2Н5)-СН2-ит.д.

2, R-q в качестве линейных или разветв- ленныхалкильных остатков с 1-7 С-атомами обозначают метил, этил, н-пропил, изопро- пил, н-бутил, изобутил, втор, -бутил, трет,- бутил, н-пентил, изопентил, втор, -пентил, неопентил, н-гексил, изогексил, н-гептил, изогептил.

2, соответственно, R4 в качестве эрал- кильных остатков с 7-10 С-атомами должны охватывать следующие остатки: -CHi-CeHs,

-СН2-СН2-СбН5, -СН2-СН2-СН2-С6Н5,

-СН2-СН2-СН2-СН2-СеН5, СН(СНз)-СбНб,

-СН2-СН(СНз)-СбН5, СН2-СН2-СН(СНз)- С6Н5, СН(СНз)-СН2-СбН5, -СН(СНз)-СН2- СН2-СбН5, -СН2-СН(СНзКН2-СбН5, СН( CeHs, СН2-СН(С2Н5)-СбН5, -СН(СзН7)- СеНб, -аСНз -СбНб, -СН2-С(СНз)2-СбН5, - СН(СНз)- СН(СНз)-СбН5, -С(СНз)2-СН2- CeHs и т.д.

Известен способ, предусматривающий применение производных цис-бицик- ло(3.3.0)-октан-3,7-диона для синтеза оптически активных карбациклинов, который включает разделение диастереомерных солей рацемической 7,7-этилендиокси-За -ок- си-цис-бицикло(3.3.0)-октан-2-карбоновой кислоты.

Также этот способ требует еще 7 реакционных стадий, чтобы исходя из сложных 3-оксоглутаровых эфиров достичь исходного материала для аналогов карбациклина. К тому же проходят промежуточную стадию получения нестабильной/ -кетокислоты,

Целью изобретения является повышение выхода и ускорение способа. Способ иллюстрируется фиг.1 и 2. В качестве ферментов для предлагаемо- го в изобретении способа предпочтительно пригодны:

Липаза-PL из AlaNgenes Липаза М из Candida cylindracea Липаза Saiken из Rhizopus Липаза :Selerotinia

й-химотрипсин из поджелудочной железы крупного рогатого скота Алкалаза Т

Эстераза из свиной печени Липаза из поджелудочной железы свиньи

Субтилизин из Bacillus subtilis, причем ферменты можно использовать как в растворенной, суспендированной или, на- пример, иммобилизованной на активированной BrCN сефарозе или на оксиранакриловых шариках форме.

1 В качестве микроорганизмов для предлагаемого в изобретении способа предпоч- . тительно пригодны:

Alcaligenes marshallii ATCC 21030 Mucorrouxie ATCC 8097 Corynebacterium egui ATCC21107 Trichoderma koningi CBS 85068 Sarcina lutea ATCC 9341

Penicilliumcitrinum ATCC 8506 Flavobacterium lutesuns IF03085 Alcaligenes paradoxus ATCC 17713 Однако также можно применять выде- ленные из микроорганизмов ферменты в раствё ёШ б й лй иммобилизованной форме.

Получаемые по способу согласно изо- бретениюоптически активные производные бициклооктана формулы (+)- представляют собой ценные промежуточные продукты для синтеза фармакологически эффективных производных простацикпина. Множество стереоспеПифических гидролизующих ферментов и микроорганизмов омыляют рацемические производные 3-эцилокси- цис-бицикло(3.3.0)-октана формулы (+)-П до оптически активных спиртов формулы (+)-, которые по своей абсолютной конфигура- ции соответствуют природному простацик- лину PCI2, Оказалось, путем сравнения спектральных и оптических свойств со сравнительными веществами, что обычно можно получить оптически активные карбацикли- новые аналоги из промежуточной стадии синтеза. Таким образом полученные продукты после отделения от неомыленных фальшивых энантиомеров (-)- можно прямо использовать для синтеза соответствую56,6 г метилового эфира 7,7-(2,2-диме- тил-триметилендиокси)-цис-бицикло(З.З.О)- октан-З-он-2-карбоновой кислоты растворяют в 300 мл этилацетата и после добавки 5.1 г диоксида платины гидрируют при 22°С и нормальном давлении до тех пор, пока не прекратится поглощение водорода. Отфильтровывают из катализатора и концентрируют в вакууме. Получают 56,8 г целевого соединения, чистота которого достаточна для получения кристаллизующего сложного эфира. Продукт можно кристаллизовать из гексана и получают 44,4 г первого кристал- лизата с т.пл, 43°С.

П р и м е р А 3. Сложный 3-эфир метилового эфира 7,7-(2,2-диметил-трцметиленди- окси)-3а -окси-цис-бицикло(3.3.0)-октан- 2/ -карбоновой кислоты.

а) Ацетат (+)100 г полученного в предыдущем примере по методу Б сырого продукта растворяют в 57 мл пиридина и 57 мл уксусного ангидрида и нагревают 3 ч при 40°С. После охлаж- дения добавляют ледяную воду, экстрагируют дихлорметаном, органическую фазу промывают 2н. серной кислотой, раствором гидрокарбоната натрия и раствором хлорида натрия, высушивают над сульфатом натрия, Концентрируют в вакууме и кристаллизуют остаток из гексана, Получают 97,7 г продукта с т.пл. 54°С.

б) Бензоат( ±)-3

5,0 г сырого сложного оксиэфира растворяют в 10 мл пиридина, смешивают с 2,47 мл бензоилхлорида и перемешивают 4 часа при 22°С. Затем медленно добавляют в 100 мл ледяной воды, перемешивают 30 минут и кристаллизат отсасывают. После высушивания и лерёкристаллизации из метанола получают 5,97 г продукта с т.пл. 102°С.

в) Изобутират ( ±)-7

2,265 г закристаллизовавшегося сложного оксиэфира растворяют в 40 мл дихлор- метана, смешивают с 4,16 мл триэтиламина и медленно с 3,14 мл изобутилхлорида. Спустя 2,5 ч при 22°С добавляют 40 мл насыщенного раствора гидрокарбоната натрия, ограническую фазу отделяют и промывают с помощью 2н. серной кислоты при охлаждении льдом и водой, сушат над сульфатом натрия и концентрируют в вакууме. Сырой продукт хроматографируют на силикагеле смесями гексана с этилацетатом. Получают 4,91 г продукта с т.пл. 43°С.

г) Бутират ( ±)-6

4,265 г кристаллизованного сложного оксиэфира растворяют в 10 мл пиридина, добавляют 4,90 мл масляного ангидрида и

перемешивают 20 ч при 22°С. Смешивают с ледяной водой, экстрагируют дихлорметаном и экстракт промывают раствором гидрокарбоната натрия, при охлаждении льдом

2н. серной кислотой и водой, сушат над сульфатом натрия, концентрируют в вакууме и хроматографируют на силикагеле с помощью смесей гексан-этилацетат. Получают 5,03 г продукта в виде бесцветного масла.

д) Неполный сукцинат ( ±)-8

4,265 г кристаллизованного сложного оксиэфира растворяют в 10 мл пиридина, добавляют туда 1,833 г 3-диметиламинопи- ридина и 1,501 г ангидрида янтарной кислоты и перемешивают 20 ч при 22°С. Затем добавляют в ледяную воду, подкисляют 2н. серной кислотой до рН 3, экстрагируют дихлорметаном, промывают раствором хлорида натрия, сушат над сульфатом натрия и

концентрируют в вакууме. Остаток обрабатывают раствором гидрокарбоната натрия, экстрагируют диэтиловым эфиром, водную фазу подкисляют до рН 3, экстрагируют дихлорметаном, промывают экстракт раствором хлорида натрия, сушат над сульфатом натрия и концентрируют в вакууме. Получают 5,04 г продукта в виде бесцветного масла.

ПримерА4. Метиловый эфир Зс/ -эцетокси-7,7-этилендиокси-цис-бицикло(3.3.0) -октан-2/ -карбоновой кислоты (+)-2

10,0 г метилового эфира 7,7-этилендиок- си-3-окси-цис-бицикло(3.3.0)-октан-2-карбо новой кислоты превращают в условиях примера А За и сырой продукт хроматографируют на силикагеле смесями гесана с этилацетатом. Получают 10,28 г продукта с т.пл. 50°С.

ПримерА5. 7,7-(2,2-диметилтриметилендиокси)-3 а -окси-цис-бицикло(3.3.0)-ок- тан-2/ -карбоновая кислота

5,0 г кристаллического сложного оксиэфира из примера А 2 перемешивают с 17.6 мл 1н. раствора гидроксида натрия в течение 30 мин при 22°С, экстрагируют этилацетатом, подкисляют при охлаждении льдом водной фазы с помощью 2н серной кислоты до рН 3, экстрагируют дихлорметаном, промывают раствором хлорида натрия, сушат

над сульфатом натрия и концентрируют в

вакууме. Получают 4,66 г продукта, который

достаточно чист для последующих реакций.

ПримерАб. 3«-ацетокси-7,7-(2,2-диметилтриметилендиокси)-цис-бицикло(3.3.

0)октан-2/ -карбоновая кислота ( ±)-9

3,13 г оксикислоты из примера А 5 растворяют в 15 мл пиридина и после добавки 2,74 мл уксусного ангидрида перемешивают 20 ч при 22°С. К полученному раствору добавляют ледяную воду, перемешивают 30 мин, экстрагируют дихлорметаном, промывают экстракт водой, сушат над сульфатом натрия, концентрируют в вакууме и хрома- тографируют на силикагеле смесями гекса- на с этилацетатом. Получают 3,04 г продукта в виде бесцветного масла.

ПримерАТ. Этиловый эфир 7,7-(2,2- диметил-триметилендиокси)-3 а -окси-цис- бицикло(3.3.0)-октан-2 /3 -карбоновой кислоты.

4,78 г, полученной в примере А 5 окси- кислоты кипятят с обратным холодильником в течение 2 дней вместе с 50 мл ацетона, 4,90 г карбоната калия и 5,72 мл иодэтана. После охлаждения отфильтровывают, фильтрат концентрируют в вакууме, смешивают с водой, экстрагируют дихлорметаном, сушат экстракт над сульфатом натрия, концентрируют и очищают остаток на силикагеле смесью гексана с этилацетатом. Получают 3,65 г продукта в виде бесцетного масла.

ПримерАЗ. Этиловый эфир За - ацетокси-7,7-(2,2-диметилтриметилендиок- сй)-цис-бицикло(3.3.0)-октан-2 /3 -карбоновой кислоты ( ±)-10.

3,10 г сложного оксиэфира из примера А 7 превращают в условиях примера А За и сырой продукт хроматографируют на силикагеле смесями гексана с этилацетатом. Получают 3,20 г продукта в виде бесцветного масла.

ПримерАЭ. Бензиловыйэфир7,7-(2,2- диметил-триметилендиокси)-3 а -окси-цис- бицикло(3.3.0)-октан-2 /3 -карбоновой кис- . лоты.

2,52 г полученной в примере А оксикис- лоты вместе с 50 мл ацетата, 3,59 г карбоната калия и 3,0 мл бензилхлорида кипятят с обратным холодильником в течение 5 дней и обрабатывают как описано в примере А 7. Получают 2,07 г продукта в виде бесцветного масла.

ПримерАЮ. Бензиловый эфир 3 а- ацетокси-(2,2-диметил-триметилендиокси)- цис-бицикло(3.3.0)-октан-2/ -карбоновой кислоты (+)-11.

1,89 г сложного оксиэфира из примера А 9 превращают в условиях примера А 3 и сырой продукт хроматографируют на силикагеле смесями гексана с этилацетатом. Получают 1,78 г продукта в виде бесцветного масла.

П р и м е р А 11. Бензиловый эфир 7,7-(2,2-диметил-триметилендиокси)-цис- бицикло(3.3.0)-окси-3-он-2-карбоновой кислоты,

К раствору 2,5 г метилового эфира 7,7- (2,2-диметил-триметилендиокси)-цис-бицикло(3.3.0)-октан-3-он-карбоновой кислоты в 50 мл толуола добавляют 1,2 мл бензилового спирта и 217 мк диметиламинопиридина и раствор кипятят с обратным холодильником

в течение 8 часов, Затем охлаждают до 25°С, добавляют насыщенный раствор хлорида натрия, экстрагируют метиленхлоридом, промывают рассолом, сушат над сульфатом магния и выпаривают в вакууме. Остаток

очищают путем колоночной хроматографии на силикагеле. Элюируют смесью гексана с уксусным эфиром (8:2) 2,6 г титульного соединения в виде бесцветных кристаллов. После перекристаллизации из смеси уксусного

эфира с гексаном получают 1,8 г бесцветных кристаллов с т.пл. 78°С.

П р и м е р А 12. Бензиловый эфир 7,7-(2,2-диметил-триметилендиокси)-3 а -окси-цис-бицикло(3.3.0)-октан-2 / -карбоновой кислоты.

1,5 г бензилового эфира 7,7-(2,2-диме- тил-триметилендиокси)-цис-бицикло(З.З.О) -октан-З-он-2-карбоновой кислоты (пример

11) при температуре кипения с обратным холодильником растворяют в 25 мл метанола. Затем охлаждают до -40°С, добавляют 470 мг боргидрида натрия и перемешивают 1 ч при -40°С. Добавляют 3,8 мл ацетона,

перемешивают 1 ч при -40°С, нейтрализуют примерно 0,7 мл ледяной уксусной кислоты и концентрируют в вакууме. Остаток смешивают со 100 мл воды, экстрагируют с помощью метиленхлорида, промывают

рассолом, сушат над сульфатом магния и выпаривают в вакууме. После хромэтогра- фии на силикагеле получают с помощью смеси гексана с уксусным эфиром (6-4) 1,4 г титульного соединения в виде бесцветного

масла. ИК-спектр ():3600, 2960, 1722, 1447см 1.

П р и м е р А 13. Бензиловый эфир 7,7-(2,2-диметил-триметилендиокси)-3 а - бензоил-окси-цис-бицикло(3.3.0)октан-2 / карбоновой кислоты,

К раствору 1,85 г бензилового эфира 7,7- (2,2-диметилтриметилендиокси)-3 а -окси- цйс-бицикло(3.3.0)-октан-2 / -карбоновой кислоты (пример А 12) в 14 мл метиленхлорида при 0°С добавляют 1,4 мл пиридина и 0,62 мл бензоилхлорида и перемешивают 0,5 ч при 0°С и 2 ч при 25°С. Затем добавляют 0,2 мл воды, перемешивают 1 ч, разбавляют метиленхлоридом, встряхивают

последовательно с водой, 5%-ным раствором гидрокарбоната натрия и водой. Сушат над сульфатом магния и хроматографируют остаток после выпаривания на силикагеле. С помощью смеси гексана с уксусным эфиром (3-2) получают 1,36 г титульного соединения в виде бесцветного масла.

ПК-спектр ():3960, 2870, 1725, 1603 см 1,

Следующие примеры осуществления служат для пояснения предлагаемого в изобретении способа.

Пример.Зг(±) метилового эфира 3 а -ацетокси-7,7-(2,2-диметилтриметилен- диокси)-цис-бицикло(3.3.0)-октан-2/ -карбо- новой кислоты растворяют в 100 мл этанола и обьединяют с раствором 1,5 г липазы -PL из Alcaligenes в 1 л 0,1 М фосфатного буфера с рН 7 в колбе Эрленмейера емкостью 2 л, Суспензию встряхивают при 30°С на ротационном встряхивателе, причем за ходом реакции следят путем анализа непрерывно отбираемых проб. По истечении времени реакции 21 ч превращается 50% испытуемого субстрата. Реакционную смесь теперь экстрагируют 3 раза метилизобутилкето- ном. Экстракты объединяют, концентрируют в вакууме досуха и для отделения непрореагировавшего ацилата сложного эфира хроматографируют через колонку с силикагелем (градиент: метиленхлорид-ме- тиленхлррид (10% ацетона). Получают 1,15 г энантиомерного чистого (+) метилового эфира 3-окси-7,7-(2,2-димётил-триметилендиок- си)-цис-бицикло-(3.3.0)-октан-2уЗ -карбоновой кислоты, который после кристаллизации из смеси гексана с диизопропиловым эфиром плавится при 64-66°С, ( ог)о20 + 26,2°(с 1,255, вСНС1з).

П р и м е р 2. 300 мг ( ±)-метилового эфира 3 а-ацетокси-7,7-(2,2-диметилтриме- тилендиокси)-цис-бицикло(3.3.0)-октан-2 / - карбоновой кислоты суспендируют в 100 мл 0.1М фосфатного буфера с рН 7, добавляют 750 мг липазы My из Candida cy.lindra- сеа и суспензию гомогенизируют с помощью ультра-Turrax. Затем смесь при комнатной температуре встряхивают на ротационном встряхивателе. Спустя время реакции 30 ч, субстрат превращается на 50%. Реакционную смесь тогда экстрагируют 3 раза эфиром, экстракты объединяют и выпаривают в вакууме досуха. Оставшийся остаток для отделения непрореагировавшего исходного материала хроматографируют с помощью градиента растворителей мети- ленхлорид-метиленхлорид - (5% ацетона) через колонку с силикагелем. Получают .105 мг (+) метилового эфира 3 -окси-7,7-(2,2-ди- метил-триметилендиокси)-цис-бицикло(3.3.0) -октан-2/З-карбоновой кислоты, который после кристаллизации из гексана имеет т.пл. 62-63°С и величину вращения (а)о +25°С (с 1,01 в ). Путем сравнительного измерения с аутеничным сравнительным стандартом установили избыток энантиомера 93,6%.

П р и м е р 3. 300 мг ( + ) метилового

эфира 3 а -ацетокси-7,7-(2,2-диметилтриме- тилендиокси)-цис-бицикло(3.3.0)-октан-2 / - карбоновой кислоты растворяют в этаноле и добавляют суспензии 750 мг липазы Saiken из Rhizopus в 100 мл 0,1 М фосфатного буфера с рН 7. Спустя 96ч встряхивают на машине для встряхивания при 28°С, затем реакционную смесь экстрагируют мети- лизобутилкетоном, экстракт концентрируют досуха и хроматографируют через, колонку с

силикагелем. Получают 112 мг (+)-метилово- го эфира 3«-окси-7,7-(2,2-диметил-тримети- лендиокси)-цис-бицикло(3.3.0)-октан-2 -карбоновой кислоты с т.пл. 64-65°С после кристаллизации из гексана. Величина вращения составляет (а)о20 + 23,8° (с 1,02 в ), избыток энантиомера после сравнительного измерения по отношению к ауте- ничному стандарту 92,5%.

П р и м е р 4. 300 мг ( ±)-метилового

эфира 3 а-ацетокси-7,7-(2,2-диметилтриме- тилендиокси)-цис-бицикло(3.3.0)-октан-2 / - карбоновой кислоты суспендируют в 100 мл 0,1 М фосфатного буфера с рН 7. Добавляют 750 мг а -Химотрипсина из поджелудочной

железы крупного рогатого скота и гомогенизируют с помощью ультра-Turrax. Затем реакционную смесь при 28°С встряхивают на ротационном встряхивателе до тех пор, пока используемый субстрат ацилата сложного эфира не превратится на 50%. После этого реакционную смесь экстрагируют многократно метилизобутилкетоном, объединенные экстракты концентрируют в вакууме досуха и с целью отделения с

неестественной конфигурацией, омылен- ных в. этом случае энантиомеров хроматографируют с помощью градиентов растворителей метиленхлорид-метиленхло- рид/ 5% ацетона через колонку с силикагелем. Фракция 1 содержит соответствующий по своей абсолютной конфигурации природному простациклину PCI2, остающийся нео- мыленным энантиомер (+ )-li. После концентрирования досуха получают 115 мг

(+)-метилового эфира 3 #-ацетокси-7,7-(2,2- диметил-триметилендиокси)-цис-бицикло (3.3.0)-октан-2/3-карбоновой кислоты в виде некристаллизующегося масла с величиной вращения (а)о +2,6° (с 1,035 в хлороформе).

П р и м е р 5. В условиях примера 4, 300 мг (+ )-метилового эфира 3 сг-ацетокси-7,7- этилендиокси-цис-бицикло(3.3.0)-октан-2 / - карбоновой кислоты в фосфатном буфере с

рН 7 вводят во взаимодействие с 750 мг субтилизина из Bacillus subtilis. После встряхивания в течение 10ч при 28°С смесь экстрагируют метйлизобутилкетоном, экстракт концентрируют досуха и хроматогра- фируют на колонке с силикагелем. С помощью градиентов растворителей мети- ленхлорид-метиленхлорид/ 4% ацетона элюируют в виде первой фракции неомы- ленный, с соответствующей природному простациклину конфигурацией (+)-энантио- мер. После концентрирования фракции досуха получают 130 мг (+)-метилового эфира

3 а -ацетокси-7,7-этилендиокси-цис-бицик- ло(3.3.0)октан-2/ -карбоновой кислоты в виде маслянистой жидкости с величиной вращения (а)о20 +2,4° (с 1,085 в хлороформе).

П р и м е р 6. Колбу Эрленмейера емкостью 2 л, которая содержит 500 мл стерилизованного в течение 30 мин при 120°С в автоклаве питательного раствора из 0,1% пептона, 0,2% Corn Sreep Liguor 0,5% глюкозы и 0,5% дрожжевого экстракта, с уста- нйвленным при 7,5 значении рН, инокулируют с помощью культуры косых палочек (Schro grbhrehen) штамма Alcaligenes marshal ATCC 21030 и в течение 48 ч встряхивают на ротационном встряхивателе. С помощью 300 мл этой выращенной культуры инокулируют ферментер емкостью 10 л, который заполнен 5 л стерилизованной питательной среды такого же состава, что и таковая выращиваемой культуры. При добавке силикона SH в качестве антивспени- вателя оставляют прорастать при 29°С при аэрации (5 л/мин) и перемешивании (220 об/мин). После фазы роста 36 часов добавляют субстрат в форме стерильно отфильтрованного раствора 30 г (+ ) метилового эфира 3 а-ацетокси-7,7-(2,2-диметилтриме- тилендиокси)-цис-бицикло(3.3.0)-октан-2 / - карбоновой кислоты в 125 мл этанола и за течением реакции следят с помощью анализа непрерывно отбираемых проб. Спустя 10

4 после добавки субстрата, превратилось 50% используемого субстрата. Содержимое ферментера теперь экстрагируют 4 раза по Зл метйлизобутилкетоном, экстракты объединяют и выпаривают в вакууме досуха. Оставшийся остаток растворяют в метаноле и для удаления силиконового масла фильтруют через складчатый фильтр. Фильтрат снова доводят в вакууме досуха и остаток для отделения непрореагировавшего с конфигурацией (-)-Н энантиомера (фракция I) хрома- тографируют через колонку с силикагелем (градиент метиленхлорид - метиленхло- рид/20% ацетона). Получают во фракции II

после кристаллизации из гексана 10,7 г (+)- метилового эфира За-окси-7,7-(2,2-диметил- триметилендиокси)-цис-бицикло(3,3.0)-ок- тан-2/З-карбоновой кислоты с т.пл. 63-64°С,

что соответствует выходу энантиомера 81,9% от теории. Величина вращения составляет (а )о +26,1 ° (с 1,3 в хлороформе), избыток энантиомера 97,5%.

П р и м е р 7. Колбу Эрленмейера емкостью 2 л, которая содержит 500 мл стерилизованного в течение 80 мин при 120°С в автоклаве питательного раствора из 3% глюкозы, 1,0% Steep Liguor, 0,2% ЫаМОз, 0,1 % КН2РСм, 0,2% К2НРСм, 0,05% MgS04 7

4Н20, 0,002% FeSCU-7 H20 и 0,05% KCI, инокулируют с помощью культуры косых трубочек штамма Mucor rouxii (ATCC 8097) и 2,5 дня встряхивают на ротационном встряхивателе при 30°С.

С помощью двойного объема этих выращенных культур инокулируют ферментер емкостью 20 л, который заполнен с помощью 14 л стерилизованной в течение 60 мин при 121°С и повышенном давлении 1,1

бар среды такого же состава, что и таковая выращиваемых культур. При добавке силикона SH в качестве антивспенивзтеля оставляют прорастать при 29°С с повышенным давлением 0,7 бара при аэрации (15 л/мин)

и перемешивании (220 об/мин). После фазы роста 15 ч добавляют субстрат в форме стерильно профильтрованного раствора 9 г (+ )-метилового эфира 3 а -ацетокси-7,7- (2,2-диметил-триметилендйокси)-цис-бицикло(3.3.0)-октан-2 / -карбоновой кислоты в 220 мл этанола и за течением реакции непрерывно следят путем анализа непрерьГв- но отбираемых проб.. .

Спустя 2 ч после добавки субстрата п ревратилось 50% используемого субстрата. Содержимое ферментера теперь экстрагируют 3 раза по 10 л метйлизобутилкетоном. экстракты объединяют и концентрируют в вакууме досуха. Остающийся остаток растворяют в метаноле и для удаления силиконового масла фильтруют через складчатый фильтр. Фильтрат снова доводят досуха в вакууме и остаток, для отделения непревращенного исходного материала, хроматографируют через колонку с силикагелем (градиент: 5 л метиленхлорида - 5 л мети- ленхлорида 10% ацетона). Получают 3,3 г (+)-метилового эфира 3 #-окси-7,7-(2.2-диме- тил-триметилендиокси)-цис-бицикло(З.З.О)октан- 2 fi -карбоновой кислоты, который после кристаллизации из смеси гексана с диизопропиловым эфиром, плавится при 64-65°С. Величина вращения составляет (а )о20 +25,7° (с 1,045 в хлороформе).

Путем сравнительного измерения по отношению к аутентичному стандарту определен энантиомерный избыток 96% вес.

Примерз. Колбу Зрленмейера емкостью 2 л, заполненную 500 мл стерильного питательного раствора из 0,1% пептона, 0,2% Corn Steep liguor, 0,5% глюкозы иО,5% дрожжевого экстракта, рН 7,3, инокулиру- ют с помощью культуры косого агара штамма Corynebactirium egui (ATCC 21107) и встряхивают 48 ч при 30°С.

С помощью двойного обьема этих выра- щенных культур инокулируют ферментер емкостью 20 л, который заполнен 14 л стерильной среды такого же состава, что и та- ковая выращиваемых культур. При добавке силикона SH- в качестве антивспенивателя оставляют прорастать при 29°С и повышенном давлении 0,7 бара при аэрации (15 л/ мин) и перемешивании (220 об/мин). После времени роста 16 ч добавляют субстрат в форме стерильно профильтрованного раствора 6 г (+ )-метилового эфира 3 а-ацеток- си-7,7-(2,2-диметил-триметилендиокси)-цис- бицикло(3.3.0)-октан-2/3 -карбоновой кисло- ты в 150 мл этанола и далее перемешивают и аэрируют. Спустя 3 ч после добавки субстрата превратилось 50% используемого субстрата. Смесь теперь экстрагируют ме- тилизобутилетоном и экстракт концентри- руют в вакууме досуха. Остающийся остаток освобождают от силиконового масла путем обработки метанолом и хроматографируют через колонку с силикагелем. Получают 1.9 г (+ )-метилового эфира За- окси-7,7-(2,2-ди- метилтриметилендиокси)-цис- бицикло(З.З.О)- октан-2 /3 -карбоновой кис- лоты, который после кристаллизации из смеси гексана с диизопропиловым эфиром плавится при 63- 65°С. Величина вращения составляет (а)о20 +25,2° (с 1,04вСНС1з).

Пример 9. В условиях примера 7 с помощью культуры штамма Trichoderma Koningi (CBS 85068) 6 г (+)-мети левого эфира 3 а -ацетокси-7,7-(2,2-диметил-триметилен- диокси)-цис-бицикло(3.3.0)-октан-2/ -карбоновой кислоты после времени ферментации 28.5 ч превращают в 2,0 г (+)-метилового эфира 3 а -окси-7,7-(2,2-диметил-тримети- лендиокси)-цис-бицикло(3.3.0)-октан-2 ft - карбоновой кислоты. Величина вращения кристаллизованного из гексана вещества составляет(а)020 +24,2°(с 1,015вСНС1з).

ПримерЮ. В условиях примера 8 с помощью культуры штамма Sareina Lutea (ATCC 9341) 6 г (+ )-метилового эфира 3 а - ацетокси-7,7-(2,2-диметил-триметилендиок- си)-цис-бицикло(3.3.0)-октан-2 / -карбоновой кислоты после времени ферментации

135 ч превращают в 1,85 г (+)-метилового эфира 3 а -окси 7,7(2,2-диметил-тримети- лендиокси)-цис-бицикло(3.3.0)-октан-2 /3 - карбоновой кислоты. Величина вращения составляет (a)D20 + 23,6° (с 1,010 в ). ПримерИ. В условиях примера 7 с помощью культуры штамма Penicillium 11Ле8ип8(АТСС 8506)6г(±)-метиловогоэфи- ра 3 а -ацетокси-7,7-(2,2-диметил-тримети- лендиокси)-цис-бицикло(3.3.0)-октан-2 /

-карбоной кислоты за 8 ч времени ферментации превращают в 2,3 г (+ )-метилового эфира 3 а -окси-7,7-(2,2-диметил-тримети- лендиокси)-цис-бицикло(3.3.0)-ок.тан-2 / - карбоновой кислоты. Величина вращения составляет(«)о20 +21,8°(с 1,05вСНС1з).

П р и м е р 12. В условиях примера 8 с помощью культуры штамма Flavobacterium lutesuns (IFO 3085) 6 г (+)-метилового эфира 3 а. -ацетркси-7,7-(2,2-диметил-триметилен- диокси)-цис-бицикло(3.3.0)-октан-2/5-карбоновой кислоты за 47 ч времени ферментации превращают в 1,8 г (+ ) -метилового эфира 3 а -окси-7,7-(2,2-диметил- триметилендиокси)-цис-бицикло(3.3.0)-ок- тан-2/ -карбоновой кислоты. Величина вращения составляет (а)о20 +21,8° (с 1,145 в ).

Пример13. 300 мг (+ )-метилового эфира 3 -бутирилокси-7,7-(2,2-диметил-три- метилендиокси)-цис-бицикло(3.3.0)-октан-2

-карбоновой кислоты растворяют в 9 мл этанола и объединяют с раствором 750 мг липазы Saiken из Rhizopus в 100 мл 0,1 М фосфатного буфера с рН 7. Суспензию встряхивают в течение 150 ч при 28°С на ротационном встряхивателе и затем экстрагируют метилизобутилкетоном. Экстракт концентрируют в вакууме досуха и остаток для отделения непрореагировавшего ацила- та сложного эфира хроматографируют через колонку с силикагелем. Получают 95 мг (+)- метилового эфира 3 о, -окси-7,7-(2,2-диме- тил-триметилёндиокси)-цис-бицикло-(З.З.О)

-октан-2/3-карбоновой кислоты с величиной вращения (a)D20 +22,8° (с 0,905 в ).

П р и м е р 14. В условиях примера 13, 300 мг(±)-метилового эфира 3 -бутирилокси- 7,7-(2,2-диметил-триметилендиокси)-цис-би- цикло(3.3.0)-октан-2/ -карбоновой кислоты в фосфатном буфере с рН 7 превращают в присутствии 750 мг алкалазы Т. Спустя 2,5 ч встряхивания при 28°С смесь экстрагируют метил-изобутилкетоном и экстракт хроматографируют на силикагеле. Получают 100 мг(-)-метилового эфира 3 2-окси-7,7-(2,2-ди- метил-триметилендиокси)-цис-бицикло(З.З.О)

-октан-2/ карбоновой кислоты с величиной вращения (a)D20 -i24,9° (с 1,020 в ).

П р и мер 15. 300 мг (+ )-метилового эфира 3 -диметилацетокси-7,7-(2,2-диметил- триметилендиокси)-цис-бицикло(3.3.0)-ок- тан-2/З-карбоновой кислоты растворяют в 9 мл этанола и объединяют с раствором 1,5 мл разбавленной 1:40 эстеразы из свиной печени в 100 мл 0,1 М фосфатного буфера с рН 7. Смесь встряхивают 1 ч при 28°С на машине для встряхивания, затем экстрагируют метилизобутилкетоном и выпаренный в вакууме экстракт хроматографируют через колонку с силикагелем. Получают 114 мг (+)- метилового эфира 3 а. -окси-7,7-(2,2-диме- тил-триметилендиокси)-цис-бицикло(З.З.О)- октан-2/ -карбоновой кислоты в виде масла, которое медленно кристаллизуется. Т.пл. 64-65°С (а),Г (с 1,010 в CHCIs).

П р и м е р 16. 300 мг (± )-метилового эфира За -карбоксипропионилокси-7,7-(2,2- диметил-триметилендиокси)-цис-бицикло (3.3.0)-октан-2/3 -карбоновой кислоты растворяют в 9 мл этанола и объединяют с раствором 750 мг липазы Sclerotinia в 100 мл 0,1 М фосфатного буфера с рН 7. После встряхивания в течение 30 ч на машине для встряхивания при 28°С устанавливают рН значение раствора равным 9,0 с помощью 0,1 н. NaOH, затем экстрагируют с помощью метилизббутилкетона и экстракт концентрируют в вакууме досуха. Получают 105 мг (+)-метилового эфира 3 а-окси-7,7-(2,2-диме- тил-триметилендиокси)-цис-бицикло(З.З.О)- октан-2 /3 -карбоновой кислоты с величиной вращения («)о20 +24,0° (с 1,08 в СНСЬ).

Пример17. 300 мг ()-этилового эфира 3 ел -ацетокси-7,7-(2,2-диметил-триметилен- диокси)-цис-би цикл о(3.3.0)-октан-2 /3 -карбоновой кислоты растворяют в 9 мл этанола и объединяют с раствором 750 мг липазы из поджелудочной железы свиней в 100 мл фосфатного буфера с рН 7. Раствор встряхивают на ротационном встряхивателе при 28°С, причем за течением реакции следят путем анализа непрерывно отбираемых проб. Спустя 1 ч времени реакции превращается 50% используемого субстрата. Смесь теперь экстрагируют 3 раза метилизобутилкетоном, экстракты объединяют, концентрируют в вакууме досуха и для отделения непрореагировавшего ацилата сложного эфира, хроматографируют на колонке с силикагелем (градиентгметиленхлорид- метиленхпорид 10% ацетона). Получают 110 мг (+)-этилового эфира За -окси-7,7-(2,2-ди- метил-три метил ендиокси)-цис-би цикл о (3.3.0)-октан-2/3-карбоновой кислоты с величиной вращения (а)о20 +23,8° (с 1,215 в ).

0

5

0

5

0

5

0

5

0

5

Пример18. В условиях примера 17, 300 мг (+)-эти левого эфира 3 «-ацетокси-7,7- (2,2-диметил-триметилендиокси)-цис-бици кло(3.3.0)-октан-2 /3 -карбоновой кислоты в течение 1 ч обрабатывают раствором 1,5 мл (разбавленным 1:40) эстеразы из свиной печени в 100 мл фосфатного буфера с рН 7. После экстракции метилизобутилкетоном и хроматографии через колонку с силикагелем получают 118 мг(+)-этилового эфира 3 а. -окси-7,7-(2,2-диметил-триметилен- диокси)-цис-бицикло(3.3.0)-октан-2 /3 -карбоновой кислоты с величиной вращения (a)D20 +24,3° (1,075 в ).

П р и м е р 19. В условиях примера 17, 300 мг (+)-бензилового эфира 3 д-ацетокси- 7,7-(2,2-диметил-триметилендиокси)-цис-би- цикло(3.3.0)-октан-2 /3 -карбоновой кислоты в течение 1 ч обрабатывают раствором 750 мг липазы PL из Alcaligenes в 100 мл фосфатного буфера с рН 7. Затем смесь экстрагируют метилизобутилкетоном, экстракт концентрируют досуха и остаток хроматографируют через колонку с силикагелем. Получают 105 мг (+ )-бензилового эфира 3 а -окси-7,7-(2,2-диметил-триметиленди- окси)-цис-бицикло(3.3.0)-октан-2 /5 -карбоновой кислоты с величиной вращения («Ъ +23,9°(с 1,045вСНС1з).

Пример 20. В условиях примера 17, 300 мг(+)-бензилового эфира 3 а-ацетокси- 7,7-(2,2-диметил-триметилендиокси)-цис- бицикло(3.3.0)-октан-2 /9 -карбоновой кислоты в течение 3 ч обрабатывают раствором 750 мг липазы My из Candida cyclindracea в 100 мл фосфатного буфера с рН 7. Затем смесь экстрагируют метилизобутилкетоном, экстракт концентрируют досуха й остаток хроматографируют на колонке с силикагелем. Получают 115 мг (+)-бензило- вого эфира 3 #-окси-7,7-(2,2-диметил-триме- тилёндиокси)-цис-бицикло(3.3.0)-октан-2 / - карбоновой кислоты с Ьелйчиной вращения (а),5°(с 1,145 в ).

Пример21.В условиях примера 8 с помощью культуры штамма Alcaligenes paradoxus (ATCC 17713) превращают 6 г (+ )-метилового эфира 3 а -ацёто ксй-7,7:(2.2- диметил-три метилен ди о кси)-цис-бицикло (3.3.0)-октан-2 /3 -карбоновой кислоты. Спустя 4 ч после добавки субстрата, превращаются 50% используемого рацемата. Смесь экстрагируют метилизобутилкетоном и экстракт концентрируют в вакууме досуха. Остающийся остаток, с целью отделения неестественной конфигурации омыленного энантиомера, хроматографируют через колонку с силикагелем. При этом во фракции 1 оказывается соответствующий по своей абсолютной конфигурации природному про- стациклину PGIa. оставшийся неомыленным энантиомер (+)-П. После того, как фракцию концентрируют досуха, получают 2,4 г (+)- метилового эфира 3 а-ацетокси-7,7-(2,2-ди- метил-триметилендиокси)-цис-бицикло (3.3.0)-октан-2/ -карбоновой кислоты в виде некристаллизирующегося масла с величиной вращения (а )о20 +2,2° (с 1.11 в

СНС1з).

Пример 22. Проведение иммобилизации липазы из свиной поджелудочной железы.

1 г липазы из свиной поджелудочной железы суспендируют в 40 мл 1М фосфатного буфера рН 7,5, прибавляют к 10 г Eupergit С.

После хорошего перемешивания инкубируют три дня при комнатной температуре. В заключение отсасывают иммобилизат, дважды промывают по 200 мл 0,1 М фосфатного буфера и выдерживают в 0,1 М при 4°С.

Энзимная реакция:

В 2-литровой эрлейнмейеровской колбе суспендируют 20 г иммобилизованной на Eupergit С-липазы в 1 л фосфатного буфера, рН 7, После этого добавляют субстрат в форме раствора 500 мг метилового эфира (1)- 3 а -ацетокси-7,7-(2,2-диметил-триметилен диокси)-цис-бицикло(3.3.0)октан-2 $ -карбо- новрй. кислоты в 25 мл этанола и встряхивают 16 ч при 30°С на встряхивающей машине.

В заключение отсасывают иммобилизованный фермент и промывают немного фос- фатным буфером. Фильтрат дважды экстрагируют по 500 мл метилизобутилкето- на, объединенные экстракты сушат над N32SCM и концентрируют досуха в вакууме. Оставшийся остаток хроматографируют на силикагелевой колонке (градиент: 1,8 л ме- тиленхлорида - 1,8 л метиленхлорида) 5% ацетон. Первая фракция содержит непревращенный ацетоксибициклооктан-метило- вый эфир, вторая фракция содержит 320 мг метилового эфира (+ )-3 а-гидрокси-7,7-(2,2- диметил-триметилен)-цис-бицикло(3.3.0)ок- тан-2/ -карбоновой кислоты с т.пл. 62-63°С. Угол вращения составляет +25,5° (с 1,001 в ).

Формула изобретения

1. Способ получения оптически активных производных (+)-бицикло(3.3.0)-октано- ла общей формулы (+)-| R j

Ck

где RI и Ra - кислород или двухвалентный остаток -0-Х-О- с X в качестве линейного или разветвленного С1-С -алкилена атомами;

Рз - остаток COOZ с Z в качестве линейного или разветвленного (и-Ст-алкила или С -Сю-аралкила атомами, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода и ускорения способа,

осуществляют ферментативный или микробиологический стереоспецифический ацилатный гидролиз рацемических производи ых 3«-ацилоксицис-бицикло(3.3.0)-ок- тана общей формулы (+)- R, R,.

CU i кз

, где RI, R2 и RS имеют указанные значения;

R4 - линейный или разветвленный Ci- C/j-алкил или фенил, используемый в качестве субстрата,

с последующим отделением образовавшегося производного (+) -бицикло(3.3.0)-октанола формулы (+ )- от неомыленного бицикло(3.3.0)-октанол-эцилата формулы (-)-, или неомыленный энантиомер формулы (+)-|| отделяют от смыленного производного бицикло (З.З.О)-октанола формулы (-)и затем подвергают химическому ацилатно- му гидролизу.

2. Способ по п.1,отличающийся тем, что в качестве ферментов используют липазу -PL из Alcaligenes, липазу My из

Candida Cylindracoa, липазу Saiken из Rhizopus, липазу Sclerotonia, «-химотрип- син из поджелудочной железы крупного рогатого скота, алкалазу Т, эстеразу из свиной печени, липазу из поджелудочной железы

свиньи или субтилизин из Bacillus subtilis в растворенной, суспендированной или иммобилизованной на активированной бром- цианом сефарозе или на оксиранакриловых шариках форме.

3. Способ по п.1, о т л и ч а ю щ и и с я тем, что в качестве микроорганизмов используют штаммы Alcaligenes morshalii АТСС 21030, Mucor rouxii ATCC 8097. Corynebacterium egui ATCC 2107,

Tricoderma koningi CBC 85068, Sarcina lutea ATCC 9341, Penicillium citrinum ATCC 8506, Flavobacterium lutesuns IFO 3085 или Alcaligenes paradoxus ATCC 17713.

4, Способ по п.З, отличающийся

тем, что в качестве ферментов используют выделенные из указанных микроорганизмов ферменты в растворенной,суспендированной или иммобилизованной форме.

Использование: получение химических соединений биосинтезом, использование ферментов или микроорганизмов для разделения рацемической смеси на оптические изомеры. Сущность изобретения: осуществляют ферментативное или микробиологическое стереоспефическое ацилатное омыление ацилатной группы ряда рацемических соединений промежуточных стадий Изобретение относится к способу сте- реоспецифического ацилатного гидролиза рацемических сложных эфиров 3-ацилокси- бицикло 3.3.0(-октан-7-он-2-карбоновых кислот до оптически активных спиртов с помощью ферментов или микроорганизмов. Он особенно пригоден для получения оптически активных производных (+)-бицик- ло(3.3.0)-октанола формулы (+) у 7-R, он (+Ы , простаци клина. Берут, например, 3 г ( ±) метилового эфира За-ацетокси-7,7-(2,2- диметил-триметилендиокси)-цис-бицикло (3.3.0)-октан-2 /3 -карбоновой кислоты, растворяют в 100 мл этанола и объединяют с раствором 1,5 г липазы-PL из Alcaligenes в 1 л 0,1 М фосфатного буфера с рН 7 в колбе Эрленмейера емкостью 2 л. Суспензию встряхивают, по истечении 21ч превращаются 50% используемого субстрата. Реакционную смесь экстрагируют 3 раза метилизобутилкетоном. Экстракты объединяют, концентрируют досуха и для отделения непрореагировавшего ацилата сложного эфира хроматографируют через колонку с силикагелем. Получают 1,15 г. энантиомерного чистого (+) метилового эфира За -окси-7,7-(2,2-диметил-триметилдиок- си)-цис-бицикло(3.3,0)-октан-2 /3 -карбоновой кислоты, который после кристаллизации из смеси гексана с диизопропиловым эфиром плавится при 64-66°С,(а)о20 +26,2° (с 1,255, в СНС1з). 3 з.п. ф-лы, 2 ил. (Л С где RI и R2 вместе обозначают атом кислорода или двухвалентный остаток -0-Х-О- с X в качестве линейного или разветвленного алкилена с 1-7 С-атомами или Рз обозначает остаток COOZ с Z в качестве линейного, или разветвленного алкила с 7-10 С-атомами. Он отличается тем. что рацемические производные 3-ацилоксицис-бицик- ло(3.3.0)-октана формулы ()-И: % А, « 9- ОСОРЦ vi 00 00 О а 00 GJ (±)-ii,

он

f-H,

°Х°

°Х°

(ы °Х°

; 5 JLLW1 i Q-COOMe COOHQ

ОН.НОН

ОН

(±)

СТАЦИЯ (Ь): ВЫХОД 90,5% 1ВСЕГО 81о/0 СТАДИЯ (С): ВЫХОД 89,5%J

СТАДИЯ (а): выход 51 %

°я

Фиг.

К° J4

0-соосиз

ОСОСНз

СТАДИЯ ii выход 88%

СТАДИЯ I ВЫХОД 85%

(ы °Х°

i

(С)

°я°

УОН

СООМе.

ft

ф-соосн3

он

Фиг. 2