Способ диагностики ларвальногоАСКАРидОзА Советский патент 1981 года по МПК A61B10/00 

1

Изобретение относится к медицине а именно гельминтологии и предназначено для диагности ранних стадий аскаридоза.

Известен способ диагностики лаврального аскаридоза с помощью специфической реакции микропреципитации на живых личинках аскарид в возрасте 7 сут. ij.

Однако выход личинок 7 сут. развития от зараженных животных подвержен большим индивидуальным колебаниям, .что затрудняет массовую постановку теста.

Известен также способ ларвальног аскаридоза путем проведения реакции между испытуемой сывороткой и сенсибилизированными антигеном эритроцитами с последующим учетом результатов их взаимодействия t2.

Однако известный способ недостаточно специфичен.

Цель изобретения - повышение специфичности.

Поставленная цель достигается тем, что реакцию проводят с эритроцитами сенсибилизированными личиночным антигеном с молекулярным весом 8000-12000, выделенным из полостной жидкости взрослых аскарид

и при положительной реакции в титре 160 и выше диагностируют аскаридоз .

Способ осуществляют следующим образом.

Сначала получают специфический личиночный антиген аскарид из полостной жидкости аскариды (ПЖЛ). Для этого 120 мл ПЖА фильтруют

0 через милипоровыЗ фильтр. Фильтрацию ШКА осуществляют через мембрану с размерами пор 140-145 А. в ячейку заливают 90,5 мл ПЖА, плотность ,750, ,95-5,0 5 выпускают 74 мл диализата 1,

,650, ,0., добавляпот 32 мл дистиллированной воды и начинают 1-ю промывку. V З мл; О 1,360} рН - 5,05

0

Добавляют 15 мл дистиллированной воды и начинают 2-ю,промывку: V 15 мл, D 0,860, рН 5,0, снова добавляют 15 мл воды и начинают 3-ю промывку: V « 19 мл; D 0,360, рН 5,2, добавляют 20 мл дистиллированной воды и начинают 5-ю промывку: V « 20 мл; D 0,045, рН 5,0. Диализат 1 и промывки объединяют V 130 мл) D 1,530 рН 5,05.

Диализат стерилизуют через милипоровый фильтр (диализат 1). Концентрат 1, полученный при фильтрации через мембрану с размером пор 140145 А имеет объем 4,5 мл, D 1,950 рН . 5,05. Затем осуществляют фильтрацию диализата 1 через мембрану с размером пор 17-18 А. Для этого в маленькую ячейку заливают 180 мл диализата 1. Выпускают 169 мл, D 0,610, рН 4,0, собирают концентрат П, V 11 гдл, D 14,10, рН 3,85.

К концентрату П V 11 мл добавлйют 22 мл дистиллированной воды и полученный раствор заливают в ячейку мембраны. 1 промывка V 22 мл, D 0,340, ,9.Добавляют 22 мл дистиллированной воды и начинают . 2-ю промывку, V 25 мл, О 0,270, рН 4,0, собирают концентрат П и промывают.

Проводят повторную коррекцию рН до 5,75-5,9, V 212 мл, О 0,550, рН 5,90 (диализат П). Фильтруют через мембрану с размером пор 9-10

В большую ячейку заливают 212 мл диализата П. Выпускают 140 мл диализата, О 0,345, рН 5,05, концентрат с V 72 мл переносят на маленькую ячейку мембраны с размером пор 9-10 . Продолжают концентрирование Выпускают 65мл диализата, О 0,470, рН 5,0. Собирают концентрат Ш: V 7,5 мл, D 2,850, который стерилизуют через ммлипоровый фильтр. Доводят рН концентрата до 7,2-8,6. Определяют специфичност антигена в реакциях иммунодиффузии, иммуноэлектрофорезах и РНГЛ.

Личиночный антиген имеет молекулярную массу 8000-12000 при электрофорезе в 0,1 М трис-ЭДТА-боратнр буфере мигрирует к аноду со скоростью соответствующей подвижности фракции о(.- р -глобулинов сыворотки крови Человека при градиенте напряжения 5 в/см, в реакции иммунодиффузии и иммуноэлектрофореза с гипериммунной сывороткой кроликов, зараженных генвазионньми яйцами аскариды, формирует полосу преципитации соответствующего протективному специфическому личиночному антигену личинок аскариды 7 сут,развития. Диагностику ларвального аскаридоза с использованием полученного специфического личиночного антигена аскариды осуществляют следующим образом .

Пример. Консервированные формалином эритроциты отмывают три раза забуференным физиологическим раствором, рН 7,2 при 2000 об/мин в течение 3-5 мин. Состав буфера, мл: 0,15 М Na2HP04 72 0,15 М KHaPOj, 28 0,9% NaCt900

Затем к 2,5% суспензии эритроцитов вливают 1:1 раствор танина в буфере (1:20000) и полученную смесь инкубируют в термостате при в течение 30 мин.

-После этого эритроциты отмь1вают три раза забуференным физилогическим раствором, рН 7,2 при 2000 об/мин в течение 3-5 мин и ресу спендируют в буфере до 2,5% суспензии.

Меофилизированный порошок специфического личиночного антигена аскариды растворяют в буфере при ,2 до концентрации белка 2 мг/мл.

Танизированные эритроциты соединяют с равным объемом антигена и полученную смесь оставляют в термостате на 3 ч при . Затем эритроциты, сенсибилизированные антигеном (диагностинум) отмывают 3 раза, ресуспендируют для получения 1,5% суспензии, консервируют мертиолатом (1:10000 конечная концентрация) и оставляют в холодильнике до следующего дня.

Все сыворотки (испытуемые, положительная контрольная сыворотка и нормальная кроличья, на которой ставят ре-акцию, то есть разводящая) инактивируют, для чего прогревают в водяной бане при в течение 30 мин. После инактивации сыворотки адсорбируют: к 1 мл сыворотки добавляют О,2 мл отмытых консервированных эритроцитов и выдерживают не менее 2-х ч, перед постановкой реакции нормальную кроличью сыворотку разводят 1:100 забуференным физиологическим раствором и на ней готовят последрвательно двукратные разведения испытуемых сывороток и контрольной положительной, начиная с 1:20 и кончая 1:1280 (7 разведений). Реакцию ставят в агглютинационных досках.

Для испытания сыворотки диагностикумом (специфичеЬким очищенным личиночным антигеном аскариды) готовят 2 ряда последовательных дву-кратных разведений (по 0,25 мл в каждой лунке).В первый ряд закапывают диагностикум по 1 капле в каждое разведение сыворотки, а во второй ряд закапывают по 1 капле анизированных эритроцитов (1,5 % суспензия - контроль сыворотки). В качестве контроля диагностикума проводят аналогичное его испытание с заведомо положительной сывороткой зараженного аскаридами кролика,, взятой на пике актителообразования (20-30 дни развития генвазии), а также с разводящей сывороткой (2-3 лунки).

Реакцию в зависимости от ее интенсивности оценивают по четырехплюсовой системе: ++++ - компактный клеточный агрегат.

+++ - ровный слой клеток со складчатыми краями на дне лунки, И- - ровный слой клеток края

местами зазубренные, + - слой клеток окружает темное узкое кольцо, плотный круглый осадок клеток в центре лунки пуговка.

За положительный результат принимают положительную реакцию не менее чем н три креста с. разведением сыворотки 1:160, принятым за диагностический..

Предлагаемый способ позволяет повысить специфичность иммунодиагностической реакции на ларвальный аскаридоз и открывает возможность проведения широких клинических и ветеринарных исследований по выявлению данного заболевания.

Формула изобретения

Способ диагностики ларвального . аскаридоза путем проведения реакции

между испытуемой сывороткой и сенсибилизированными антигеном эритроцитами с последующим учетом результатов их взаимодействия, отличающийся тем, что, с целью . повышения специфичности, реакцию проводят с эритроцитами сенсибилизированными личиночным антигеном с молекулярным весом 8000-12000, выделенным из полостной жидкости взрослых аскарид и при положительной реак0ции в титре 160 и выше диагносциру- ют аскаридоз.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1.Лейкина E.G. Изучение ин витро 5 антител, вырабатываемых у белых шл-

шей. asc Jubr.- Медицинская паразитология и паразитные болезни, 1947 т. 16, № 4.

2.Полетаева О.Г.,Заточкина Э.Г. 0 Применение реакции РИГА для определения длительяости сезона заражения в очаге аскаридоза,- Медицинская паразитология и паразитные болезни, 1974, 3, с. 273-278.