Способ бактериологической диагностикиВОСпАлиТЕльНО-НАгНОиТЕльНыХ зАбОлЕВАНийлЕгКиХ Советский патент 1981 года по МПК A61B10/00 

культив1 рования клеток оптимального со става. Процесс обработки ткани и культивиро вания сводится к следующему. Щадяще удаляют висцеральный листок плевры. Отрезают относительно больши участки периферических отделов ткани лег кого (4,0x4,0X1,0 дм), пригодные для культивирования. Эти кусочки разрезают на более мелкие (0,5x1,0 дм) в чашке Петри с тенлой () питательной сме сью, содержаш,ен среду 199-48%, гидролизат лактальбумина 47%, сыворотку крупного рогатого скота 5%, стрептомицин хлор-кальциевый ко.мплекс 300-500 ед/мл. ..4Iu.iV4 C/J,/:VJvl. Кусочки иоследовательнп пппхгы яи-1г п гг/. Кусочки последовательно промывают в четырех сменах вышеназванной питательной смеси. С использование.м луны удаляют стенки сосудов и бронхиол так, чтобы не повредить клетки и .мембраны альвеол, содержимое альвеолярных полостей выжимают, кусочки отмывают последовательно в четырех сменах питательной смеси вышеназванного состава, но не содержащей стрептомицина. Отжатые от питательной смеси кусочки ткани помещают в ииактивированную при 56°С в течение 30 мин сыворотку здоровых доноров АВ (IV) группы. Промытые в сыворотке в 1ечеиие 10 мин кусочки переносят в сухую чашку Петри, в которой ткань измельчают до раз.мера 0,5-1,0 м.м и помещают в коническую колбу на 500 мл с 300 мл дезагрегирующей с.меси, состоящей из следующих или. T6™oSk: st f.f,,7™- -) /и- .j.. j./tiv-l u./JJ IjJrUl сина 86, 0,02%-ный раствор версена 10, сыворотка человека АВ (IV) группы (инактивирована при 56°С в течение 30 мин) 4. Кусочки ткани дезагрегируют на магнитной мешалке при 37°С в темноте в течение одного-двух часов. Суспензию клеток профильтровывают через однослойный марлевый фильтр и центрифугируют в микробиологических пробирках при 800 об/.мин в течение 10 мин. Насадочную жидкость сливают, осадок щадяще ресуспендируют в питательной смеси, приготовленной для культивирования и состоящей из следующих компонентов, %: среда Игла 10, среда 199, 30, гидрализат лактальбумина 30 с сывороткой крупного рогатого скота 2, сыворотка человека (получена от здоровых доноров АВ (IV) группы, резус-положительная, инактивирована при 5i6°C в течение 30 мин) 20, раствор глютамина в среде 199, добавленного из расчета 500 мкг/мл питательной смеси, и вновь центрифугируют нри указанном режиме. Иадосадочную жидкость удаляют, осадок ресуспендируют в необходимом объеме вышеназванной питательной с.меси для культивирования, суспензию профильтровывают через двуслойный марлевый -,,„ ..j..iwrino,n .«арлевыи фильтр. Проводят подсчет содержания эпи- ,6 телиоподобных клеток в 1 мл приготовленной суспензии в камере Горяева с .использованием лейкоцитарного меланжера и 3%-ного раствора уксусной кислоты с метиленовы.м синим. Клеткн подсчитывают полностью в двух-четырех сетках камеры с вычислением содержания среднего количества клеток в одной сетке и с соответствующим пересчетом на 1 мл, как при иодсчетс лейкоцитов. Рабочую концентрацию клеток доводят до 2X10 клеток в I мл. Готовую суспензию клеток разливают но 1 .1Л в м{ кробнологические пробирки равпого размера (длиной 15 см, диаметром 11ЯЧ. гг м . т, .--.- 11 1,3 см) без покровных стекол ...v., - для под,,г,.,-, ... счета жизнеспособных клеток с витальны.ми (расителями после инкубации с микроорганиз.ма.ми (стафилококки), с покровными стекла.ми - для морфологических исследований. Па каждый исследуемый Н1тамм стафилококков и контроль выделяют по три-четыре-иять пробирок. Пробирки стационируют в штативы под углом 6. Перед закрывание.м пробирок резиновыми пробками, в случае необходи.хюсти, поверхность суспензии продувают либо газовой смесью с 5% С02, либо последними порция.ми выдыхаемого воздуха до получения рН питательной смеси, равной 6,8. Культивирование проводят при 37°С в термостате с водяной рубашкой до получения монослоя клеток (14-21-28 суток). Процесс формирования монослоя культуры ткани первично дезагрегированных клеток ГЛаНИ первично ЯРЧЯГПОТ И -р Ф р -сГхТ™сЕ периферических участков легкого состоит из нескольких этапов. Смену питательной смеси проводят через дней, в зависимости от изменения рН. Объем полученной суспензии клеток и количество пробирок с одинаковым монослоем клеток к .моменту инкубации определяется количество.м исследованных штаммов стафилококков. По сформировании монослоя клеток (7-14-21-28 сутки) в пробирки с культурой добавляют суспензию .микроорганизмов в концентрации 10® .микробных тел в 1 мл 0,15 М раствора NaCl (рП 7,2-7,4), о I мл в каждую пробирку, в контрольные робирки по 1 мл 0,15 М раствора NaCl предварительным сливом 1 .мл питательой с.меси. Спустя один час инкубации добавляют о 1 мл интательной среды Р1гла без слива успензии стафилококков и физиологичесого раствора из контрольных пробирок. пустя шесть часов инкубации содержиое из пробирок сливают (процедура проедена в термостате), осторожно наливат 3 мл 0,25%-иого раствора трипсина, одогретого до 37°С, который через минуу удаляют и добавляют новую порцию рипсина по 0,2 .мл, с которым культуры нкубируют в тер.мостате при периодичеJJ г нкуоируют В термостате при периодичеком встряхивании до отделения клеток от