СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВИРУСОЦИДНОГО ДЕЙСТВИЯ СРЕДСТВ И СПОСОБОВ БОРЬБЫ С ВИРУСОМ МЕШОТЧАТОГО РАСПЛОДА ПЧЕЛ Российский патент 2020 года по МПК A01K51/00 C12Q1/70 

Изобретение относится к области ветеринарии и пчеловодства, в частности, к выявлению средств, обладающих вирусоцидным действием на вирус мешотчатого расплода пчел. Данный способ может использоваться в научно-исследовательских лабораториях, а также в производственных ветеринарных лабораториях.

В настоящее время вирусные болезни (мешотчатый расплод, острый паралич пчел и др.) широко распространены на пасеках по всему миру, являются актуальной проблемой.

Уровень техники

Известно, что вирус мешотчатого расплода на культуре клеток почки теленка (ПТ) вызывает изменения в виде разрушения целостности монослоя, появления вакуолей и пикноза ядер [Калинин А.Г., Гальнбек Т.В., Сотников А.Н., Володько Д.В., Потапова И.В., Щукина А.В Цитопатологические изменения в культуре клеток при культивировании мешотчатого расплода пчел. Ж. Ветеринария и кормление. №3, 2018, с 43-46].

Известен способ определения вирусоцидного действия средств на вирус мешотчатого расплода пчел в культуре ткани куриных фибробластов in vitro, при котором к одному объему материала с вирусом мешотчатого расплода добавляют один объем нормальной сыворотки крупного рогатого скота и восемь объемов 0,5%-ного водного раствора испытуемого препарата, смесь выдерживают 60 мин при комнатной температуре, после чего делают десятичные разведения в культуральной питательной среде 199 и проводят заражение культуры ткани куриных фибробластов, помещая в термостат при t=37°C с соответствующими контролями, учет результатов осуществляют через 3 сут. микроскопией, сравнивая титр вируса в опыте и контроле, что указывает на присутствие вируса как в опыте, так и в контроле [Деканадзе A.M. Уничтожение возбудителя мешотчатого расплода. Пчеловодство. - 1982. - №2. - С. 19-20]. Данный способ мы берем за прототип.

Недостатком данной методики является разведение заражающего материала, что приводит к уменьшению заражающей дозы вируса и уменьшение количественных и качественных изменений.

Технической проблемой является необходимость создания способа диагностики, основанной на признаках проявления вируса в клетках с более точными качественными показателями изменений.

Сущность изобретения

Техническим результатом является выявление цитопатологических признаков проявления вируса мешотчатого расплода в культурах клеток.

Предложенный способ определения вирусоцидного действия средств борьбы с вирусом мешотчатого расплода пчел заключается в следующем:

Испытуемое средство добавляют к вируссодержащей суспензии (вирус мешотчатого расплода) in vitro в концентрациях, определенных дозировкой исследуемого препарата, выдерживают испытуемую смесь в холодильнике при t=+4-8°C в течение 2 сут., после чего смесь доводят до t=+15-25°C, фильтруют через миллипоровый фильтр с диаметром пор 45 нм., монослой культуры клеток почки теленка (ПТ) отмывают поддерживающей питательной средой ИГЛА МЕМ+ Гидролизат лактальбумина 0,5% в соотношении 1:1 и заражают, добавляя испытуемую смесь на монослой культуры клеток, через 2 ч. адсорбции вируса при t=+34±1°C испытуемую смесь удаляют с монослоя, клетки отмывают поддерживающей питательной средой ИГЛА МЕМ+ Гидролизат лактальбумина 0,5% в соотношении 1:1, вносят питательную среду ИГЛА MEM+ Гидролизат лактальбумина 0,5% в соотношении 1:1 и культивируют вирус в течение 4-7 сут. в термостате при t=+34±1°C, ежедневно просматривая с целью выявления цитопатогенного действия, в контрольных флаконах ростовую питательную среду заменяли на поддерживающую, вторым контролем служили культуры клеток, зараженные вируссодержащей суспензией без добавления препарата.

На этапе контроля результатов в качестве эталона служат чистая культура клеток ПТ, культура клеток ПТ контактирующая с вируссодержащим материалом, далее через 4 сут. проводят микроскопию, окрашивают клетки азур-эозином по Романовскому-Гимза, выявляют признаки воздействия вируса мешотчатого расплода пчел на клетки ПТ - разрушение целостности монослоя, появление вакуолей, пикноз ядер, при наличии этих признаков вирус присутствует в испытуемой смеси и препарат не подействовал на вирус мешотчатого расплода пчел, отсутствие данных признаков подтверждает гибель вируса.

Осуществление изобретения иллюстрируется следующими примерами:

Пример 1. Вируссодержащий материал in vitro вносят в водяную баню с t=50°C на 10 мин., после охлаждения до t=+15-25°C содержимое пробирки профильтровывают через миллипоровый фильтр с диаметром пор 45 нм., монослой культуры клеток почки теленка (ПТ) отмывают поддерживающей питательной средой ИГЛА МЕМ+ Гидролизат лактальбумина 0,5% в соотношении 1:1, наносят вируссодержащий материал на монослой и выдерживают 2 ч. при t=+34±1°C для адсорбции вируса, после чего вируссодержащий материал удаляют, монослой отмывают поддерживающей питательной средой ИГЛА МЕМ+ Гидролизат лактальбумина 0,5% в соотношении 1:1, вносят поддерживающую среду ИГЛА MEM+ Гидролизат лактальбумина 0,5% в соотношении 1:1 и помещают в термостат при t=+34±1°C, через 4 сут. окрашивают азур-эозином по Романовскому-Гимза; при микроскопии выявляют разрушение монослоя, образование вакуолей и пикноз ядер, аналогичное наблюдают в контроле, где применили вируссодержащую смесь; вирус в опыте не погиб и вызвал изменения, на что указывает контроль с вирусом, в контроле с чистой культурой клеток признаки воздействия вируса мешотчатого расплода пчел отсутствовали.

Пример 2. Вируссодержащий материал in vitro вносят в водяную баню с t=100°C на 5 мин, после содержимое пробирки охлаждают до t=+15-25°C, затем содержимое пробирки профильтровывают через миллипоровый фильтр с диаметром пор 45 нм., монослой отмывают поддерживающей питательной средой ИГЛА МЕМ+ Гидролизат лактальбумина 0,5% в соотношении 1:1 и проводят заражение культуры в течение 2 ч. при t=+34±1°C, после чего вируссодержащий материал удаляют, монослой отмывают поддерживающей питательной средой ИГЛА МЕМ+ Гидролизат лактальбумина 0,5% в соотношении 1:1, вносят поддерживающую среду ИГЛА MEM+ Гидролизат лактальбумина 0,5% в соотношении 1:1 и помещают в термостат при t=+34±1°C, в качестве контроля используют вирусный материал, не подвергавшийся тепловой обработке, через 4 сут. окрашивают азур-эозином по Романовскому-Гимза; при микроскопии контроля выявляют разрушение монослоя, образование вакуолей и пикноз ядер; вирус в опыте погиб и не вызвал изменения, на что указывает контроль с вирусом, в контроле с чистой культурой клеток признаки воздействия вируса мешотчатого расплода пчел отсутствовали.

Пример 3. В пробирку с вируссодержащим материалом вносят 0,5 мл. водного раствора препарата Dutrion (диоксид хлора 0,005%) в дозировке, указанной в инструкции, помещают на 2 сут. в холодильник при t=+4°C, после содержимое пробирки доводят до t=+15-25°C и фильтруют через миллипоровый фильтр с диаметром пор 45 нм, монослой отмывают поддерживающей питательной средой ИГЛА МЕМ+ Гидролизат лактальбумина 0,5% в соотношении 1:1, затем заражают культуры клеток ПТ в течение 2 ч. при t=+34±1°C, после чего вируссодержащий материал удаляют, монослой отмывают поддерживающей питательной средой ИГЛА МЕМ+ Гидролизат лактальбумина 0,5% в соотношении 1:1, вносят поддерживающую среду ИГЛА MEM + Гидролизат лактальбумина 0,5% в соотношении 1:1 и помещают в термостат при t=+34±1°C, через 4 сут. окрашивают азур-эозином по Романовскому-Гимза; при микроскопии выявляют разрушение монослоя, образование вакуолей и пикноз ядер, аналогичное наблюдают в контроле, где применяют вирусосодержащую смесь; вирус в опыте не погиб и вызвал изменения, на что указывает контроль с вирусом, в контроле с чистой культурой клеток признаки воздействия вируса мешотчатого расплода пчел отсутствовали.

Предложенный способ определения вирусоцидного действия средств позволит провести скрининг на вирусоцидность средств, выявить эффективные лечебные и дезинфицирующие средства при мешотчатом расплоде пчел и других вирусных заболеваниях пчел.

Предложенный способ апробирован нами с положительными результатами на 15 пробах в 2019 г. в лаборатории болезни пчел ФГБНУ ФНЦ ВИЭВ РАН.

Предложенный способ определения вирусоцидного действия средств найдет широкое применение в научно-исследовательских лабораториях, а также в производственных ветеринарных лабораториях. Выявленные предложенным способом лечебные средства позволят оздоровить от вирусных заболеваний пчел все пасеки страны.

Список используемой литературы:

1. Калинин А.Г., Гальнбек Т.В., Сотников А.Н., Володько Д.В., Потапова И.В., Щукина А.В Цитопатологические изменения в культуре клеток при культивировании мешотчатого расплода пчел. Ж. «Ветеринария и кормление». №3, 2018, с 43-46

2. Деканадзе A.M. Уничтожение возбудителя мешотчатого расплода. Ж. «Пчеловодство». - №2. - 1982. - - С. 19-20 (Прототип)

Изобретение относится к области ветеринарии и пчеловодства, в частности к выявлению средств, обладающих вирусоцидным действием на вирус мешотчатого расплода пчел, и может использоваться в научно-исследовательских лабораториях, а также в производственных ветеринарных лабораториях. Способ определения вирусоцидного действия средств борьбы с вирусом мешотчатого расплода пчел включает добавление препарата к вируссодержащей суспензии, добавление полученной смеси в культуру клеток, культивирование вируса в термостате, микроскопию исследуемых культур клеток и контроль результатов. При этом вируссодержащий материал in vitro смешивают с испытуемым препаратом в концентрациях, определенных дозировкой исследуемого препарата и выдерживают испытуемую смесь в холодильнике при t=+4°C в течение 2 суток. Смесь доводят до t=+15-25°C и фильтруют через миллипоровый фильтр с диаметром пор 45 нанометров. После чего монослой культуры клеток почки теленка отмывают поддерживающей питательной средой ИГЛА МЕМ + Гидролизат лактальбумина 0,5% в соотношении 1:1 и проводят ее заражение в течение 2 часов при t=+34±1°C. Затем смесь удаляют с монослоя, клетки отмывают поддерживающей питательной средой ИГЛА МЕМ + Гидролизат лактальбумина 0,5% в соотношении 1:1 и в культуры вносят поддерживающую питательную среду ИГЛА МЕМ + Гидролизат лактальбумина 0,5% в соотношении 1:1. В контрольных флаконах ростовую среду заменяли на поддерживающую, вторым контролем являлась культура клеток, зараженная вирусом. Все культуры инкубируют при t=+34±1°C до 4-7 суток, ежедневно просматривая с целью выявления цитопатогенного действия. Через 4 суток культуры клеток окрашивают азур-эозином по Романовскому-Гимза, выявляют признаки воздействия вируса мешотчатого расплода пчел на клетки почки теленка - разрушение целостности монослоя, появление вакуолей, пикноз ядер. При наличии этих признаков вирус присутствует в испытуемой смеси и препарат не подействовал на вирус мешотчатого расплода пчел, а отсутствие данных признаков подтверждает гибель вируса. Изобретение обеспечивает создание способа диагностики, основанной на признаках проявления вируса в клетках, с более точными качественными показателями изменений. 3 пр.

Способ определения вирусоцидного действия средств борьбы с вирусом мешотчатого расплода пчел, включающий добавление препарата к вируссодержащей суспензии, добавление полученной смеси в культуру клеток, культивирование вируса в термостате, микроскопию исследуемых культур клеток и контроль результатов, отличающийся тем, что вируссодержащий материал in vitro смешивают с испытуемым препаратом в концентрациях, определенных дозировкой исследуемого препарата, выдерживают испытуемую смесь в холодильнике при t=+4°C в течение 2 суток, смесь доводят до t=+15-25°C и фильтруют через миллипоровый фильтр с диаметром пор 45 нанометров, после чего монослой культуры клеток почки теленка отмывают поддерживающей питательной средой ИГЛА МЕМ + Гидролизат лактальбумина 0,5% в соотношении 1:1 и проводят ее заражение в течение 2 часов при t=+34±1°C, затем смесь удаляют с монослоя, клетки отмывают поддерживающей питательной средой ИГЛА МЕМ + Гидролизат лактальбумина 0,5% в соотношении 1:1 и в культуры вносят поддерживающую питательную среду ИГЛА МЕМ + Гидролизат лактальбумина 0,5% в соотношении 1:1, в контрольных флаконах ростовую среду заменяли на поддерживающую, вторым контролем являлась культура клеток, зараженная вирусом, все культуры инкубируют при t=+34±1°C до 4-7 суток, ежедневно просматривая с целью выявления цитопатогенного действия, через 4 суток культуры клеток окрашивают азур-эозином по Романовскому-Гимза, выявляют признаки воздействия вируса мешотчатого расплода пчел на клетки почки теленка - разрушение целостности монослоя, появление вакуолей, пикноз ядер, при наличии этих признаков вирус присутствует в испытуемой смеси и препарат не подействовал на вирус мешотчатого расплода пчел, отсутствие данных признаков подтверждает гибель вируса.