Способ получения иммобилизированного простагландина,обладающего антиагрегационной активностью Советский патент 1982 года по МПК A61K31/5575 

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННОГО ПРОСТАГЛАНДИНА, ОБЛАДАЮШЕГО АНТИАГРЕГАЦИОННОЙ

АКТИВНОСТЬЮ

1

Изобретение относится к биологии, точнее к биохимии, и может найти применение в экспериментальных медико-биологических исследованиях.

Известны простагландины, обладающие высокой биологической активностью 1.

Однако известные простагландины быстро выводятся из организма при введении в свободном состоянии. Одним из распространенных способов удлинения времени пребьшания веществ в организме является их иммобилизация на длительно циркулирующем носителе.

Целью изобретения является получение иммобилизованного простагландина, обладающего антиагрегационной активностью.

Поставленная цель достигается тем, что способ получения иммобилизованного простагландина, обладающего антиагрегационной активностью, характеризуется тем, что эритроциты или тромбоциты крови обрабатывают глутаровым диальдегидом и затем инкубируют метиловым эфиpo простагландина при следующем соотнощении: эритроциты - метиловый эфир простагландина 1-0,001:0,058, тромбоциты - метиловый эфир простагландина 1-0,006:0,0296.

Способ осуществляется следующим образом.

Пример 1. Иммобилизация метилового эфира 5-йод-простагландина li на эритроцитах.

5 К 20 мл свежей крови кролика добавляют 0,1 объема 3.8 цитрата натрия и центрифугируют при 1000 об/мин в течение 15-ти мин. 4 мл плотного осадка эритроцитов промывают 2 раза 4-кратными объемами 0,15 М

Q хлористого натрия и суспензируют в 4 мл этого раствора. К 8-ми мл взвеси клеток добавляют 17,6 мл раствора О.Р/о глутаро вого диальдегида на 0,1 М фосфатном буфере (рН 6,8), содержащим 0,15 М хлористый натрий и инкубиру ют 75 мин при перемешивании при 20°С. Затем отмывают сус пензию центрифугированием при 2500 об/мин в течение б мин 4 раза 10-кратными объемами физиологического раствора. К 1,6 мл густой взвеси модифицированных эритроци, тов добавляют раствор метилового эфира 5-йод-простагландина Ц в 0,5 мл диметилсульфоксида с тем, чтобы конечная концентрация простагландина составила 4,5 мг/мл. Препарат инкубируют при 4°С в течение 18 ч при качании на щуттель-аппарате. Суспензию отмывают 7 раз 10-кратными объемами физиологического раствора и осаждают центрифугированием. В полученных препаратах содержание простагландина контролируют спектрофотометрически после обработки аликвоты препарата концентрированной серной кислотой при 420 нм. В данном препарате простагландина содержится 5,8 мг на 994,2 мг сухого веса эритроцитов.

Пример 2. Иммобилизация на тромбоцитах метилового эфира 5-йод-простагландина li.

Тромбоциты получают центрифугированием крови при 1000 об/мин, а обогащенную тромбоцитами плазму центрифугируют при 3000 об/мин. К 8-ми мл взвеси тромбоцитов в 0,15 М хлористого натрия добавляют 17,6 мл раствора 0,1 /о глютарового диальдегида на 0,1 М фосфатного буфера (рН 6,8). К 0,5 мл взвеси обработанных тромбоцитов добавляют 0,6 мл 0,1 М фосфатного буфера рН 6,8 и 0,4 мл раствора простагландина в диметилсульфоксиде, так что конечная концентрация простагландина составляет 5 мг/мл. Смесь инкубируют при качании на шуттель-аппарате в течение 1 ч при 20°С, затем осаждают препарат центрифугированием и отмывают 6 раз 20-кратными объемами физиологического раствора. При/ указанной обработке 11,2 Мг простагландина иммобилизовывают на 988,8 мг сухого веса тромбоцитов.

Пример 3. Определение устойчивости препарата метилового эфира 5-йод-простагландина li.

Препарат иммобилизованного метилового эфира 5-йод-простагландина Ij, меченный по тритию (метка содержится исключительно в молекуле простагландина), и меченный препарат свободного простагландина вводят в бедренную мышцу мышей. На первые сутки после введения неиммобилизованного простагландина составляет 142 800 распадов в минуту, на месте введения иммобилизованного препарата 110 760 расп/мин. Через трое суток после введения в контроле составляет 27 534 расп/мин при введении иммобилизованного препарата 50 845 расп/ мин. Таким образом, процент сохранения свободного простагландина через трое суток составляет 19,3%, а иммобилизованного 46%. Следовательно, препарат иммобилизованного простагландина элиминируется из депо значительно медленнее свободного простаглаадина.

Примеер 4. Оценка антиагрегационного действия препарата иммобилизованного метилового эфира 5-йод-простагландина 1.

Исследуют агрегационную способность тромбоцитов кролика под влиянием иммобилизованного простагландина. Для этого обогащенную тромбоцитами плазму получают из цитратной крови (соотношение

цитрата и крови 1:9) путем центрифугирования при 1000 об/мин. Агрегацию кровяных пластинок исследуют по методу Борна на фотоэлектроколориметре ФЭК-56М с графической регистрацией на самопишущем

потенциометре КСП-4. Агрегацию вызывают добавлением 0,2 мкг/мл АДФ к 0,9 мл обогащенной тромбоцитами плазмы. При инкубации с иммобилизованным препаратом метилового эфира 5-йод-простагландина 1, агрегация составляет 20%. Неиммобилизованный препарат того же простагландина в этих условиях снижает агрегацию до 16%. Таким образом, в условиях иммобилизации не происходит снижение антиагрегационной активности простагландина.

Пример 5. Иммобилизацию метилового эфира простагландина 8 мл взвеси эритроцитов или тромбоцитов модифицируют 17,6мл 0,1% раствора глютарового диальдегида. 1,6 мл суспензии модифицированных эритроцитов инкубируют 0,4 мл раствора 16,8 мл метилового эфира простагландина в диметилсульфоксиде. Препарат инкубируют при 4°С в течение 18 ч при качании на щуттель-аппарате. Суспензию отмывают 7 раз

5 10-кратными объемами физиологического раствора и осаждают центрифугированием. Содержание метилового эфира простагландина 1 в образцах иммобилизованного простагландина составляет 1,8-2,2 мг/г сухого веса.

0 Несвязавшийся с носителем эфир простагландина тщательно удаляют многократной промывкой. Определенная часть простагландина при этом прочно связывается с модифицированными клетками крови. После иммобилизации простагландин сохраняет свои биологические свойства. Так метиловый эфир 5-йод-простагландина Ij , иммобилизованный на тромбоцитах, обладает таким же антиагрегационным действием на суспензию тромбоцитов, как и свободный метиловый эфир 5-йод-простагландина Ц. Иммобилизация предотвращает быстрое распределение простагландина по всему организму. При внутримышечном введении мышам иммобилизованный на эритроцитах метиловый эфир простагландина в 2,4 раза

больше, чем свободный эфир простагландина.

Испытания показали, что предлагаемый препарат простагландина обладает выраженным антиагрегационным действием и может быть использован для изучения механизма действия простагландинов.

Формула изобретения

Способ получения иммобилизованного простагландина, обладающего антиагрегационной активностью, характеризующийся тем, что эритроциты или тромбоциты кро56

ви обрабатывают глутаровым диальдегидомИсточники информации,

и затем инкубируют метиловым эфиром прос-принятые во внимание при экспертизе

тагландина при следующем соотношении:1. Ferreira J. Н., Vane J. R. Prostaэритроциты - метиловый эфир простаглан-glandins their disapperance from and

дина 1-0,001:0,058, тромбоциты - мети-release into circulation. Nature, 1967,

ЛОВЫЙ эфир простагландина 1-0,006:0,026.5 216, p. 868-873.

982695