Среда для быстрой дифференциации токсинообразующих грибов Советский патент 1981 года по МПК C12N1/14 

1

Изобретение относится к области микотоксикологии и может быть использовано при разработке способов определения пораженности кормов и продуктов питания определенными видами токсинообразующих грибов - возбудителей алиментарных микотоксикозов человека исельскохозяйственных живот- . Них, а также для ранней и быстрой идентификации образуемых микромицетами токсинов.

Предлагаемая среда может найти применение не только для выявления грибов, продуцирующих микотоксин коевую кислоту, но и для дифференциации этой группы грибов ,от сопутствующих микроорганизмов, населяющих грубые корма и другие пищевые продукты.

1 1звестна среда для быстрой идентификации и определения количества A.flarus и родственных организмов следующего состава,%: 1,5 триптона, 1,0 дрожжевого экстракта; 0,05 цитрата железа ; 1,5 агара., на которой по ярко желто-оранжевой пигментации колоний и среды отделяют афлаток. синобразующие штаммы грибов от беспигментных сопутствующих микроорганизмов

Однако образуемая по данной среде устойчивая характерная для токсических штаммов аспаргиллов желтооранжевая пигментация не всегда яв- ляется диагностическим признаком. Подобную пигментацию колоний образуют -во время роста на ней виды A.sulphureus, А.sc1erotiorum, A.thomlt, которые как продуценты афлатоксинов

10 не известны.

Кроме того,естественный компонент в данной среде - дрожжевой экстракт может менять свой химический состав в зависимости от способа приготовле15ния, условий и сроков хранения и т.д. Поэтому рассматриваемую среду следует отнести в группу полусинтетических сред неопределенного состава, для которых присущ один об20щий недостаток: на них повторность одинаковых условий для культивирования грибов часто бывает трудно достигаема.

Известна также среда Чапека, имею25щая следующий состав, г/л: глюкоза или сахароза 20-30; NaNO 2-3,

ПЛП a WCl V-sJQA «.V J f t4 f t у

0,5-0,7,

0,8-1,2; МдЗОл- 7Hj2:0 ( KCI 0,S-0,8; FeS040,Ol-0,02, дистиллированная вода до 1л, агарагар 15-20 2.

30

Это одна из часто применяемых синтетических сред для выращивания микроскопических грибов. Однако ввиду ее универсальности она не может быть использована для дифференциации отдельных видов или групп микромицетов, в том числе продуцентов микотоксинов.

Целью изобретения является быст рая дифференциация токсинообразующих грибов, продуцирующих коевую кислоту.

Поставленная цель достигается тем что в среде Чапека увеличено содержание углеводов, а также дополнительно введены лимонная кислота и хлорное железо при следующем соотношении компонентов, г/л: .

Сахароза или глюкоза 50,0-100,0 Натрий азотнокислый 2,0-3,0 Калий фосфорнокислый однозамещенный 0,8-1,2 Магний сернокислый 0,5-0,7 Калий хлористый 0,,8 Железо зернокислое закисное0,01-0,02

Железо хлорное 1,2-1,8 Лимонная кислота 0,3-1,0 Агар-агар15-20

Вода-дистиллированная До 1 л В процессе приготовления среды компоненты растворяют в такой последовательности: первыми растворяют в дистиллированной воде минеральные соли (NaNO/j, КН,Р04, Мд .0 , КС 1 затем лимонную кислоту, Ре50д и FeCl, последней - сахарозу и глюкозу.

Для лучшего растворения компонентов среду подогревают до 50-60 С и периодически перемешивают круговыми движениями в колбе или стеклянной палочкой. После полного растворения всех компонентов прозрачную желтосоломенного цвета среду агаризуют.

Высокое содержание углеводов при сравнительно низком уровне азота в среде обеспечивает оптимальные условия для образования грибами коевой кислоты.

Лимонная кислота обуславливает .кислую реакцию среды (2,5-3,0), необходимую для превращения микромицетами сахара в коевую кислоту, а такЯсе служит одновременно консервантом, который обеспечивает рост на данном субстрате грибов-кислотообразователей, в частности видов аспергиллов, для многих штаммов котор х лимонная кислота часто является естественным продуктом метаболизма и препятствует при этом развитию на нем других видов гифальных грибов, дрожжей, бактериальной .флоры и актиномицетов. Поэтому предлагаемую среду можно использовать в работе, соблюдая условия стерильности посева исследуемого материала (V также разлив среды в стеририльную посуду), не подвергая ее специальной термической стерилизации .

Дифференциация токсинообразующих грибов-продуцентов коевой кислоты при помощи разработанной среды основана на использовании характерной качественной реакции ее с хлорным железом. Образуемая при взаимодействии коевой кислоты с 0,1%-ным раствором хлорного железа красная окраска крайне чувствительна «Si позволяет- обнаружить ее в субстрате при разведении ,1:2000000 (5-5,5 мкг/мл)

Вишнево-красная пигментация среды вблизи колоний грибов, растущих на среде с индикатором, означает присутствие в субстрате коевой кислоты.

Для сравнения высеваемости видов аспергиллов и дифференциации среди них продуцентов коевой кислоты на . предлагаемой среде и среде-прототипе производят на них посев микробных ассоциаций, содержащий, помимо исследуемых видов рода A.spergollus, другие виды грибов, а также актиномицеты.

Дифференциацию аспергиллов-продуцентов коевой кислоты производят по вишнево-красной пигментации колоний и субстрата - при высеве ассоциаций микробов на предлагаемую среду.- или общепринятыми методами, включающими .выделение чистых культур грибов-продуцентов, культивирование их на жидких средах с последующим колориметрическим определением содержания коевой кислоты в культуральных жидкостях грибов и проверкой токсичности ее в опытах на лабораторных животных - пр высеве ассоциаций микроорганизмов на среду-прототип.л.

На среде-прототипе отдельные виды аспергиллов либо вообще не выделяются, либо из-за отсутствия оптимальных условий не выявляют способности продуцировать коевую кислоту.

Появление ярко- или темно-красных .зон (размер зоны и интенсивность ее окраски зависал от концентрации в . субстрате коевой кислоты) может быть отмечено вблизи колоний, едва заметных невооруженным глазом, и почти всегда у колоний диаметром 2-10 см.

Это преимущество предлагаемой среды дает возможность быстро произвести дифференциацию токсинообразующих микомицетов по признаку (образуют они или не образуют токсин коевую кислоту уже через 24-48 ч после инокуляции среды исследуемым материалом а не в течение 7-10 сут, как это требует общепринятый прием анализа неблагополучных кормов при высеве их на общеприменяемые среды.

Предлагаемая среда определенного состава элективна для роста аспергиллов, в том числе потенциальных ток5 870429 синообразователей - A.fiavus, что дает возможность использовать ее для дифференциации этой группы грибов от сопутствукхцих микроорганизмов, населяюцих корма и другие субстраты, а также характеризуется свойством с быстро выявлять среди микомицетов виды и штгаалл продуцирующих микотокг син - коевую кислоту. изобретения Среда для быстрой дифференциации токсинообразупцих грибов, включашцая рахарозу или глюкозу, натрий азотнокислый, калий фосфорнокислый од-. 5 нозамещенный, калий хлористый, магНИИ сернокислый, железо сернокислое закисное, агар-агар и воду, о т личающаяся тем, что, с целью повьшеиия элективности для 20 токсинообразухяцих грибов, она дополнительно содержит лимонную кислоту и хлорное железо, причем компоIQ6 ненты содержатся в среде в следуютем соотнсяаении, г/л: Сахароза или плюкоза 50-100 Натрий азотнокислый 2-3 Калий фосфорнокислый однозамеценный ,2 Калий хлористый 0,5-0,8 Магний сернокислый 0,5-0,7 Железо сернокислое закисное0,01-0,02 Железо хлорное I ,8 Кислота лимоиная 0,3-1,0 Агар-гитар15-20 Вода дистюшировантиая До 1 л Источники информация, принятые во внимание прк экспертизе .% 1. Руководство для изучения по«венных микроорганизмов н их метаболитов. М., изд.МГУ, 1967. 2. Спесйвцева Н.А;, Хмелевский Б.Нъ Санитария кормов. М., Колос, 1975, с.254-296 (прототип).