Способ получения иммобилизованной лакказы Советский патент 1981 года по МПК C12N9/02 C12N11/14 

Изобретение относится к биохимии, в частности к способам получения иммо билизованной лакказы. Лакказа - фермент, относящийся к классу оксидаз, катализирующий процес переноса электронов с органических субстратов на молекулярный кислород. С использованием ферментов этого клас са, в частности лакказы, связывают возможность создания кислородного электрода биохимического топливного элемента. Известны способы получения иммобил зованной лакказы адсорбцией на конканавалин-А-сефарозе и ковалентным связыванием с сефарозой, активированной бромцианом fl. Однако поскольку сефароза и конканавалин-А-сефароза не обладают электронной проводимостью, указанные препа раты лакказы не могут быть использова ны для катализа электрохимических про цессов . Известен cnocq6 получения иммибилизованной лакказы адсорбцией на элект тронопроводящем носителе - саже L2j. Однако в процессе иммобилизации фермент теряет 80% исходной активности, а полученный этим способом препарат иммобилизованной лакказы отличается невысокой термостабильностью (константа скорости его инактивации втрое больше по сравнению с нативным ферментом). Цель изобретения - повьшение активности и термбстабильности иммобилизованной лакказы. Поставленная цель достигается тем, что электронопроводящий носитель сажу предварительно обрабатывают бычьим сывороточным альбумином СВСА, после чего осуществляют связывание лакказы с носителем в присутствии, так называемогоi реагента Вудворда - N-этш1-5-фенил-изоксазолий-3 -сульфоната. 3 При этом предпочтительно указанный реагент Вудворда использовать в 5-8кратном избытке С по весу по отношени к лакказе. (Наилучшие результаты 90%-ого сохранения первоначальной активности получают при 5-кратном избытке реагента Вудворда по отношению к лакказе. При увеличении этого соотношени активность полученного препарата умен шается и при 20-кратном избытке реактина Вудворда составляет 59% от перво начальной активности). Термостабильность полученной иммобилизованной лакказы в интервале температуры 20-65 С не отличается от ста бильности нативного фермента. Активность иммобилизованной лакказы может достигать 90% от исходной. Пример. 4 мг предварительно измельченной сажи МП-100 суспендируют в 0,5 мл дистиллированной воды, содержащей 3 мг КСА. Суспензию перемешивают в течение часа, а затем центри фугируют в течение 10 мин при 6000 д. Супернатант отделяют и осадок промывают 4-5 раз дистиллированной водой. К полученной саже с адсорбированным БСА добавляют 0,5 мл раствор а лак 10 мол казы в воде, содержащей 8,7 (0,05 мг) фермента, затем 0,4 мг реагента Вудворда. Полученную суспензию выдерживают в течение часа, после чего осадок отделяют центрифугированием и промывают 0,1 М фосфатным буфером с рН 6,0. Полученньш препарат сохраняет 90% исходной активности. Таким образом, получают электронопроводяЕщй стабильный препарат иммобилизованной лакказы, обладающий высокой активностью. Лакказа, иммобилизованная на саже предлагаемым способом, может быть использована для из24готовления электродов биохимических топливных элементов. Создание электродов на основе окислительно-восстановительных ферментов, иммобилизованных на электронопроводящем носителе, создает реальные предпосылки для разработки биохимических источников тока высокой мощности. Кроме того, лакказа, иммобилизованная на саже, может быть использована для создания чувствительных сенсоров для количественного определения органических соединений, являющихся субстратами лакказы. Формула изобретения 1.Способ получения иммобилизованной лакказы путем связывания фермента с электронопроврдящим носителем - сажей, отличающийся тем, что, с целью повьшения активности и термостабильности целевого продукта, сажу предварительно обрабатывают бычьим сывороточным альбумином, а связывание с ферментом осуществляют в присутствии К-этил-5-фенил-изоксазолий-3 -сульфоната. 2.Способ по п. I, отличающийся тем, что М-этил-5-фенил-изоксазолий-3 -сульфона используют в 5-8-кратном избытке (по весу по отношению к лакказе. Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1.Stanley С. Frocher, К. Е. Eriksson Свойства гликопротеина лакказы, иммобилизованной двумя методами. Acta Chem. Scand.jlB 29, 1975, p. 691-694. 2.Авторское свидетельство СССР по заявке № 2791581/26, кл. С 25 В 11/12, 1979 (прототип)