8-(6-Аминогексил)-аминоциклоаденозинмонофосфат-хлортриазинилцеллюлоза в качестве аффинного сорбента циклоаденозинмонофосфатзависимых белков Советский патент 1982 года по МПК C07H19/20 C12N11/00 G01N33/56 

(5) 8- (6-АМИНОГЕКСИЛ) -АМИНОЦИКЛОАДЕНОЗИНМОНОФОСФАТ-ХЛОРТРИАЗЙНИЛЦЕЛШЛОЗА В КАЧЕСТВЕ АФФИННОГО СОРБЕНТА

ЦИКЛОАДЕНОЗИНМОНОФОСФАТЗАВИСИМЫХ БЕЛКОВ Изобретение относится к области биохимии, в частности, к новому химическому соединению -8(6-аминогексил аминоциклоаденозинмонофосхрат-хлортриазинилцеллюлозеТ-цл NHtCHjj KхСНг„ I0-F . . «ч он где. R остаток целлюлозы, которое является продуктом иммобилизации 8-(6-аминогексил)-аминЬциклоаденозинмонрфосфата на целлюлозе с помощью Z,,6-трихлор-.5-триазина. Данное соединение в силу своей химической структуры обладает сродст вом к цикло-АМФ-зависимым белкам (на пример ферментам) и может .быть испол зовано в качестве аффинного сорбента для выделения или очистки этих Оелков путем аффинной хроматографии. Известен иммобилизованный на сефарозе 8-(6-аминогексил)-аминоциклоаденозинмонофосфат, обладающий аналогичными свойствами и используемый в качестве аффинного сорбента при хро атографической очистке цикло-АМФ-зависимой протеинкиназы из еменников лосося l3. Синтез указанного аффинного сорбента основан на известной методике 2J, и заключается в иммобилизации лиганда -8-(6-аминогексил)аминоциклоаденозинмонофосфата на матрице - активированной бромцианом сефарозе. Содержание иммобилизованного аналога цикло-АНФ-60 м нуклеотида на 1 г сухой сефарозы. Для хрЪматографии на данном сорбенте достигается 10-крат-, ная степень очистки фермента Однако данный аффинный .сорбент обладает рядом недостатков. в частности, был установлен факт относительно быстрого отщепления лиганда от матрицы 1 Скорость отщепления при рН , т.р. условиях, при которых преимущественно проводит ся аффинная хрЬ атЬграфия цикло-АМФ3ависимых ферментов, составляет -0,5 нм/ч. Недостатком известного сорбента является также его низкая устойчивость, механическая прочность и невы сокая степень очистки. Целью изобретения является новый более стабильный и устойчивый аффинный сорбент, позволяющий достичь Ъолее высокой кратности степени очисткиЦель достигается свойствами нового соединения -8-(б-аминогексил)-ами циклоаденозинмонофосфат-хлортриазинит(целлюлозы, используемого в качест ве аффинного сорбента цикло-АМФ-зависимых белков о Соединение получают по известному способу ft - иммобилизацией 8-(6-ами ногексил)-аминоцикло-АМс) на целлюлоз с помощью 2,,6-трихлор-5-триазина Пример 1 о Получение сорбента, К 1 ,5 г целлюлозы (Chemapol , ЧССР приливают 2 мл триэтиламина в мл ацетона, через 10 мин к смеси добавл ют 1 г 2,,6-трихлор-5-триазина в . 20 мл холодного ацетона. Активирован ный таким образом носитель через 30 мин промывают смесью ацетона и ди тиллированной воды И:1), затем приливают 10 мл раствора 8-(6-аминогексил)-аминоцикло-АМФ (3500 спектрофот метрических единиц). Суспензию остав ляют при перемешивании при/комнатной Температуре на 16 ч, по истечении этого времени полученный препарат промывают 2 я смеси ацетона и дистил лированной воды ) и 0,5 л 0,1 М боратного буфера. Количество иммобилизованного лиганда в полученных аффинных сорбентах определяют по содержанию фосфора что в пересчете составляет моль нуклеотида на 1 г сорбента. Пример 2. Изучение взаимодействия иммобилизованного на целлюлозе 8- 6-аминогексил)-аминоциклоАМФ с цикло-АМФ-.зависимым белком. Для проверки взаимодействия с цик яо-АМФ-зависимым белком к 0,5 г полученного аффинного сорбента прилива ют 1 мл исследуемого белка в концентрации of 1 до 10 оптических единиц (1-10 мг/мл по Ajgj,). В качестве белкового препарата используют фракцию после очистки на гидроксилапатите при выделении протеинкиназы из мозга свиньи 5 В зависимости от исходной концентрации исследуемого блока с полученным сорбентом взаимодействует 7192% белка соответственно. Содержание иммобилизованного лиганда в полученном сорбенте остается постоянным как в процессе хроматографии, так и при длительном хранении. Хранение возможно в высушенном состоянии при комнатной температуре или при 4 С в виде суспензий. Сорбент обладает значительной механической прочностью, хорошей фильтруемостью, что позволяет проводить многократную хроматографию под давлением без нарушения структуры препарата и использовать его в препаративных целях. Достигаемая 15 кратная степень очистки.-. Формула изобретения . 8- (6-Аминогексил )aминoциклoaдeнoзйнмoнoфocфaт-xлopтpиaзинилцeллюлoзaформулы TjlHj ЦД, jLm(cHj),-NH4 Sr ж я . о |j он где R - остаток целлюлозы. в качестве аффинного сорбента циклоаденозинмонофосфатзависимых белков. Источники информации, принятые во вниманИ|е при экспертизе Ь Jergll В., Gull ford Н., Mosbach К. Blospecffic Affinity Chromatography of an Adenosine 3:5 Cyclic Monophosphate - Stimulated Protein Kinase (Protanine Kinase from Trout Test is) by using innobilized Adenine Nucleotides, Biochem., J., V. 139, , 197, 41-Й8. 2. Axen P., Porath J., Ernback S. Chenical Coupling of Peptides and

Proteins to Polysaccarides by Means of Cyanogen Halldes, Nature, 1967, V. 21, 1302-130.

3. lesser G.I., Fisch H.-U., Schwyzer R. LInitatloh of Affin ty Chronatography: Sepharose - Bound Cycl Ic 3,5 -Adenosine MonophosphateV

FEBS Letters , 1972, v. 23, ff J , 56-53.

t. Иммобилизованные ферменты, под ред. Березина И.В., Антонова В.К,, Мартинека К.,М., 197б,изд-воМГУ;т. 1,83.

5. Hesterova Ml, Saschenfeo L., Vaslllev V., Severin E. Biochim. Biophys. Acta, 1975, 37, 271-281.