Способ получения аффинного сорбента Советский патент 1981 года по МПК C08B37/00 

(5) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АФФИННОГО СОРБЕНТА

I

Изобретение относится к области биохимии и может быть использовано в аффинной хроматографии для выделения аденозинтрифосфат (АТФ -зависимых ферментов.

Известен способ получения аффинного сорбента путем введения ароматического кольца в BrCN-активированную сефарозу, получения 8-амино-АТФ и присоединения последнего азосочетанием к матрице, содержащей ароматическое кольцо l.

Недостатками известного способа являются многостадийность процесса использование труднодоступных и дорогих реактивов, употребляемых при введении ароматического кольца и азосочетании (например, N-сукцинимидный эфир бензойной кислоты, палладиевый катализатор), а также взрывоопасных (MaNO) и высокотоксичных (HNOQ) соединений.

Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому является

способ получения аффинного адсорбента, заключающийся в бромирЪвании аденозинмонофосфата (АМФ.до 8Вг-АМФ ( с выходом последнего приблизительно , автоклавировании 8Вг-АМФ при в присутствии гексаметилендиамина (выход 8(6-аминогексил) амино АМФ составляет 85Й), последующей защите алифатической аминогруппы 8-(б-аминогексил)амино-АМФ обработкой этиловым эфиром трифтортиоуксусной кислоты, активировании фосфатной группы нуклеотида путем обработки высушенного продукта упариванием с абсолютным пиридином АМФ карбонилдиимидазолом в сухом диметилформамиде, добавлении к активированному продукту неорганического пирофосфата до образования eCCFj-C-NHCCH)О

-NH) АТФ, снятии защиты с алифатической аминогруппы oбpaбoJки8(CF -C-NH(CH,2.). ) щелочью и О присоединением полученного 8-(6-аминогексил)аминоаденозинтрифосфата к BrCN-активированной сефарозе 2, Недостатками способа являются многостадийность процесса, низкий вы ход продукта, использование дефицитных и дорогих реагентов (карбонил диимидазол, этиловый эфир, трифторти уксусная кислота) , использование без водных растворителей, таких как пири дин и диметилформамид, и необходимость работы с ними в условиях, исключающих попадание влаги, что требу ет специальных мер безопасности. Цель изобретения - упрощение способа и увеличение выхода целевого продукта. Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения аффинного сорбента, включающему обработку производного аденозина и присоединение полученного в результате обработки 8-(6-аминогексил/ аминоаденозинтрифосфата к BrCN-активированной сефарозе, в качестве производного аденозииа используют динат риевую соль аденозинтрифосфата и обработку проводят насыщенной бром ной водой-до получения-8 бромаденозинтрифосфата и затем гексаметилендиамином в присутствии эквимолярной смеси йодистого калия и сульфата ме ди 3 качестве катализатора в течени i|-6 ч при . Сущность предлагаемого способа получения аффинного сорбента заключается в следующем. Динатриевую соль АТФ обрабатывают насыщенной бромной водой до полу чения 8 Зг-АТФ. Продукт реакции выд ляют ионообменной хромотографией н ДЭАЭ-сефадексе. Готовят реакционную смесь, содер жащую 8Вг-АТФ, гексаметилендиамин, смесь Си50ф и KJ, выдерживают -6 ч при . О полноте прохождения реакции судят по сдвигу максимума поглощения реакционной смеси с 2бО до 280 нм. Продукт реакции выделяют ионообменной хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе. Полученный 8- 6-аминогексил)амин -АТФ выдерживают в течение 16 ч с BrCN-активированной сефарозой. Продуктом реакции является сорбент, со держащий АТФ, ковалентно присоедине ный через С-8 положение. П р и мер 1. Синтез 8Вг-АТФ. 1 ммоль (551 мг) АТФ (натриевая сол 4 растворяют в itO мл 1 М CHjCOONa(,0), добавляют 10 мл насыщенной бромной воды. Реакционную смесь оставляют при комнатной температуре в темном месте Добавляют до обесцвечивания раствора. Реакционную смесь упаривают до масла, растворяют в 50 мл и наносят на колонку (1 ,6x70 см с ДЭАЭ-сефадексом А-25 (в НСО -фермер Промывают колонку линейным градиентом (О,1-0,Ц М) триэтиламмоний дикарбоната (ТЭАБ) рН 7,5. Скорость элюирования 90 мл/час, объем элюата 1,8 л. Фракции, -соответствующие ВВг-АТФ, объединяют и упаривают на ротационном испарителе. Остаток ТЗАБ удаляют повторным упариванием с водным этанолом. Выход ОВг-АТФ составляет 0,75 ммоль (75). Синтез NH (СН/)МН-АТФ. О, 75 ммоль 8Вг-АТФ растворяют в 10 мл , добавляют 5 г NH,2(CH)NH2, 20 мг CuSO и 20 мг К1. Выдерживают реакционную смесь ч при 50®С. О полноте прохождения реакции судят по сдвигу максимума поглощения реакционной смеси с 2бО нм до 280 нм. Реакционную смесь разбавливают дистиллированной водой до 500 мл и наносят на колонку (2,6л70 см) с ДЭАЭ целлюлозой (в НС01, . Скорость нанесения 90 мл/чах;. Промывают колонку линейным градиентом (о , О ,5 М) ТЭАБ рН 7,5- Скорость элюирования 60 мл/ч, объем элюата 1,5 л фракции, соответствующие 8-(б-аминогексил)амино-АТФ, объединяют и упаривают на ротационном испарителе. Остаток ТЭАБ удаляют повторным упариванием с водным этанолом. Выход NHQ(CHj) NH-АТФ составляет 0,i(1 ммоль (551) . Пример 2. 0,75 ммоль ВВг-ДТФ растворяют в 10 мл НлО, добавляO lU20 мг CuSO и ют 5 г NH 20 мг К1, Выдерживают реакционную смесь 6 ч при . О полноте про-, хождения реакции судят по сдвигу максимума поглощения реакционной смеси с 2бО нм до 280 нм. Реакционную смесь разбавляют дистиллированной водой до 500 мл и наносят на колонку (2, см) с ДЭАЭ-целлюлозой в (НСО1|-форме) . Промывают колонку линейным градиентом (.0,1- 0,5 М) ТЭАБ рН 7,5. Фракции, соответствующие 8-(6-аминогексил)амино-АТФ, объединяют и упаривают на ротационном испарителе. Остаток ТЭАБ удаляют повтор ным упариванием с водным этанолом. Выход NHi2(CHi)NH-AT0 составляет 0,29 ммоль (6S%)Присоединение NH/ji(CH/;)4NH-AT0 к BrCN-активированной сефарозе. 9 г сухой BrCN-активированной сефарозы промывают на фильтре 300 мл холодно 0,001 NHC1, затем 100 мл холодного 0,1 N (рН 9,5) и переносят в колбу. Добавляют 5 мл раствора (30 ммоль) МН(СН2.)бМН-АТФ в 0,5 М Na,jCOj (рН 9,5) .Перемешивают 16 ч при . Промывают сорбент 0,1 М (рН 9,5) до отсутствия опти ческой плотности и затем водой до нейтрального значения рН. Выход сорбента составляет 9г. Емкость сорбента 3 ммоль АТФ на 1 г сухого носителя. Использование предлагаемого способа получения аффинного сорбента по сравнению с известным позволяет сократить число стадий получения (аффинного сорбента, исключить трудо емкую стадию автоклавирования, требующую специального оборудования, и стадии, связанные с необходимостью работать с безводными растворителями улучшить условия труда за счет исклю чения из процесса токсичных реагентов (таких как Пиридин, диметилформа мид), а также разместить процесс на обычном производстве органического синтеза без особых требований к оборудованию помещения и без специальных, мер по технике безопасности, за0«менить дефицитные реактивы на более доступные коммерческие препараты, увеличить выход целевого продукта. Формула изобретения Способ получения аффинного сорбента, включающий обработку производного аденоэина и присоединение полученного в результате обработки 8-(6-аминогексил)аминоаденозинтрифосфата к BrCN-активированной сефарозе, отличающийся тем, что , с целью упрощения способа и увеличения выхода целевого продукта, в качестве производного аденозина используют динатриевую соль аденозинтрифосфата и обработку проводят насыщенной бромной водой до получения 8-бромаденозинтрифосфата и затем гексаметилендиамином в присутствии эквимолярной смеси йодистого калия и сульфата меди в качестве катализатора в течение ч при 40-50 С. Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1. G.W.K.Kuntz et.al. Isolation of Phpsphoglycerate kinases by Affinity Chromatography, European -journal of Biochemistry, 1978; /85, N 2, p. 93-501. 2.Jau P, Trayer et al. Preparativu of Adenosirie Nucleotide Derivatives Suitable for.Affinity,Chromatography, The Biochemical Jornal. 1974, V139, № 3, p. 609-623 (прототип).