Штамм aSpeRGILLUS INSUетUS-г-116-продуцент декстраназы Советский патент 1982 года по МПК C12N15/00 

1

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касас ся штамма микроорганизма - продуцента фермента декстраназы, исполь- g зуемого в пищевой промышленности, на стадии фильтрации и очистки сахарных сиропов, а также в медицине для профилактики и лечения кариеса зубов.

Известны различные микроорганизмы,д способные синтезировать декстраназу из штаммов различных грибов и бактерий.

Известен, например, штамм Peuici &aum-f umicueosiom ГВЕМ-Р129-продуцент декстраназы. .Фермент получают на жид-- КОЙ питательной среде, при значении рН6,5-7, регулируемом добавлением кирлоты для усиления процесса ферментации и повышения выхода декстранаЗБГ 1.

. Наиболее близким к предлагаемому. по технической сущности и достигаемому положительному эффекту является штамм гриба PeuiciEBixnn piscarim 25 БИМ Г-102. Уровень внеклеточной эндодекстраназной активности этого, штамма на среде Чапека-Докса с 1% декстрана и 0,5% кукурузного экстракта достигает 290 ед/л на 5-е сутки 30

культивирования. Осахаривакидая.. (экзодекстраназная) внеклеточная активность составляет при этом 32 ед/мл 2,

Недостатком известных штаммов является низкий уровень внеклеточной декстраназной активности.

Цель изобретения - получение штамма гриба с высоким уровнем внеклеточной декстраназной активности.

Предлагаемый штамм AspergiECus in- suetus Г-116 является активным односпоровым вариантом исходного музейного штамма AspergiECus insuetus 99 ХФВНИИ. Штамм получен путем много-кратного рассева исходной культуры на среды со специфическим индуктором (нативным бактериальным декстраном) с последующим отбором активных вариантов. Декстраназная активность предлагаемого штамма в 2 раза превышает активность исходного. Штамм хранится в музее культур Института микробиологии АН Белорусской ССР при ч-4-+5с на картофельно-декстроз ном агаре (шифр штамма-Г-11б) и в музее культур Промышленных микроррга низмоБ института ВНИИГенетика (коллекционный номер ЦМПМ Г-136).

Штамм Aspergi6€us insuetus Г-И6 обладает внеклеточной экходекстраназной активностью до 80 ед/мл,энзодекстраназная активность культурной жидкости достигает 700 ед/л.

Штамм гриба AspergiEPus insuetus Г-116 характеризуется следующими культурально морфологическими и биохимическими признаками.

Морфологические признаки. На сред Чапека-Докса вегетативный мицелий септированный, разветвленный, толщина гиф 3-4 мкм. Конидиеносцы несептированные, неветвящиеся, прямостоящие Конидиальная головка образована вершинным вздутием конидиеносца 7-9 6-7 мкм, одним слоем стеригм 12,5.1Ь, мкм и цепочками конидий., конидии гладкие, шаровидные, диаметром 4,5-6,0 мкм.

Кудьтуральные признаки. На среде Чапека-Докса с сахарозой на 4-е сутки при 28°С колония круглая, выпукла с ровными краями, 2 см в диаметре, с густым коротким опушением. Центр колонии слегка приподнятый/ обратная сторона колонии кремового цвета.

На среде Чапека-Докса с декстраном 4-х суточная колония круглая, выпуклая, в центре приподнятая, имее 3 см, края ровные, воздушный мицелий белый, пушистый. В иентре колонии зона спороношения коричневого цвета, 01,3 см. Вокруг колонии зона просветления шириной 5-6 мм.

На картофельно-декстрозном агаре колония очень выпуклая с ровными краями. На 4-е сутки имеет диаметр около 2 см, густой, короткий, белый воздушный мицелий. В центре колонии мицелий серо-зеленый. На 6-е сутки диаметр колонии достигает 4 см. Мицелий приобретает серо-зеленую окраску в центре - серо-коричневую, видны споры. По краю колонии кромка белого воздушного мицелия.

Биохимические признаки. Aspergi 6us insuetus Г-116 особенно активно сбраживает глюкозу, сахарозу, ксилозу, сербит и дульцит,менее активно галактозу, лактозу,маннит.Слабо ассимилирует глицерин и арабинозу.Молоко пептонизирует очень медленно, желатину разжижает воронкообразно, интенсивно гидролизует крахмал, исполь зует аммонийную, нитратную и белковую, формы азота. Нитраты восстанавливает.

iilTaMM гриба Aspergi66us insuetus Г-А16 выращивают глубинным способом на среде с нативным декстраном.

Внеклеточную энзодекстраназную активность определяют вискозиметрическ по разжижающей способности фермента с использованием в качестве субстрата 0,8%-ного раствора нативного бактериального декстрана. Для этого к 7,5 мл 0,8%-ного раствора декстрана в 0,1 М Na-ацетатном буфере (рН 5,0)

добавляют 0,5 мл культуральной жидкости (после соответствующего разведения) . Через определенные интервалы времени измеряют время истечения реакционной смеси на вискозиметре ВПЖ-2 с диаметром капилляра 0,62 мм, термостатированном при . Активность рассчитывают по формуле

1 РА - -5 dtQ где А - активность ед/л;

концентрация субстрата;

v - относительная вязкость;

t - время реакции, с. Внеклеточную экзодекстраназную активность выражают в глюкоэных единицах. Единица активности соответствует количеству освободившихся при действии фермента на субстрат вос-станавливаквдих групп прй за 1 мин, эквивалентному одному микромолю глюкозы. Для этого к 0,75 мл 0,15%-ного раствора декстрана .в .. 0,1 М Na-ацетатном буфере (рН 5,0) добавляют 0,25 мм культуральной жидкости (после соответствуизвдего разведения) . Гидролиз проводят в течение 10 мин при .Образовавшиеся редуцирующие сахара определяют методом Самоги-Нельсона. Активность рассчитывают по формуле CR

10-ISO где А - активность ед/мл;

С - концентрация редуцирующих веществ в реакционной смеси, % мкг/мл;

R - разведение культуральной жидкости;

10 - время гидролиза, мин; 180 - моль глюкозы.

Пример. Выращивание штамма AspergiCEus insuetus Г-И6 проводят на питательной среде, содержащей,%: нативный декстран 1,0; NaNO. 0,3, КНаРС 4 0,1; КСе 0,05, MgSO4 0,05; РеЗОд кукурузный экстракт 0,5. Культивирование ведут в колбах на 100 мл с 2Ь мл среды на качалке (200 об/мин) При 28-29°С в течение 5 сут.

Посевным материалом служит 2-недельная культура, выращенная на картофельно-декстрозном агаре. Смыв с поверхности агара (пробирка на 25 мл дистилированной воды) в количестве 4% от объема сре,цы вносят в колбы. Максимальный уровень активности культуральной жидкости наблюдается на 5-е сутки культивирования. К этому времени энзодекстраназная активность достигает 700 ед/л, а экзодекстранаэная - ВО ед/мл.

Отличающей особенностью предлагаемого штамма Aspergi66us insuetus Г-llti является способность к активному росту и синтезу декстраназы на синтетической среде без добавления

кукурузного экстракта или других факторов роста. При этом не наблюдается существенных отличий в уровне декстранаэной активности культуральной жидкости полученной на среде с кукурузн{лм экстрактом и синтетической среде.

(Итамм AspergiCCus insuetus Г-116 по сравнению с известным обладает в 2,5 раэа более высоким уровнем декстраназной активности культуральной жидкости.

формула изобретения

Штамм AspergiBEus insuetusГ-116 (коллекция культур промышленных микроорганизмов института ВНИИгенетика коллекционный номер ЦМПМ F-136), продуцент декстраназы.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1.ЗаявкаЯпонии 52-31429, кл. С 12 D 13/10, опублик. 1977.

2,Авторркое свидетельство СССР I 747889, кп. С 12 D 13/10.