Способвыделения фермента тромболитического действия Советский патент 1977 года по МПК C12D13/00 C07G7/26 

Изобретение относится к производству ферментных препаратов тромболитического действия, преимущественно урокиназы, с помощью ионитов.

Известен способ выделения урокиназы сорбцией на каолине с последующей элюцией 1%-ным раствором этакридина при рН 4,5, подщелачиванием элюата до рН 6,0 и вторичной сорбцией урокиназы из элюата на карбоксиметилцеллюлозе с последующей элюцией 0,36 М фосфатным буфером с рН 6,5 1.

Недостатком этого способа является длительность процессов, трудоемкость проведения стадий сорбции и элюции урокиназы на ионитах в статических условиях, a также низкий выход конечного продукта, связанный с неудачным выбором ионитов.

Известен способ выделения урокиназы путем сорбции -на силикагеле из фильтрата, полученного после отделения осадка балластных веществ при подщелачивании мочи до рН 7,5 с последующей элюцией урокиназы 4%-ным водным раствором аммиака, осаждением урокиназы из элюата при рН 1,5, последующим растворением осадка в воде, подщелачиванием раствора NaOH до рН 8,0, отделением выпавшего при этом осадка и диализацией и лиофилизацией фильтрата.

В извеством способе дальнейшую очистку полученного препарата урокиназы проводят

путем сорбции в динамических условиях на карбоксильномкатионите - амберлите

IRC-50 в водородно-натриевой форме с последующей десорбцией урокиназы 0,5 М раствором NaCl 2.

Этот известный способ очень трудоемок и многостадийный (15 стадий), при этом конечный продукт окрашен пигментами, содержащимися в исходном сырье, a элюция

4%-ным водным раствором аммиака с рН 12,0 ведет к частичной денатурации фермента.

Наиболее близким решением к предлагаемому изобретению по технической сущности и

достигаемому результату является известный способ выделения фермента тромболитического действия, включающий очистку исходного раствора от примесей, пропускание раствора через колонку с анионитом ФАФ в хлор-

форме для депигментации раствора, пропускания депигментированного раствора через карбоксильный катионит КМТ в водородной форме при рН 6,1, промывку катионита для удаления балластных белков и элюцию фермента фосфатным буфером 3.

Недостаток известного способа заключается в том, что при получении урокиназы он сложен и трудоемок из-за необходимости проведения стадии осаждения белков сульфатом

аммония из культуральной жидкости, сушки и последующего растворения осадка.

Получаемый по известному способу тромболитический фермент имеет явно выраженные иммуногенные свойства.

С целью снижения стоимости фермента и упрощения способа при получении урокиназы по предлагаемому способу в качестве исходного раствора используют мочу людей, его очистку от примесей осуществляют путем введения едкой щелочи до рН 7,5-8,0, очищенный раствор подкисляют перед пропусканием через колонку с анионитом ФАФ до рН 3,5-5,7, а промывку катионита КМТ осуществляют фосфатным буфером 0,05-0,2 М при рН 5,8-6,0.

Способ осуществляют следующим образом.

Исходный раствор, в качестве которого используют мочу людей, очищают от примесей путем введения едкой щелочи (КОН или NaOH) до рН 7,5-:8,0, после чего очищенный раствор подкисляют раствором соляной кислоты до рН3,5-5,7.и пропускают через колонку, содержащую набухщий в воде анионит ФАФ, в хлор-форме для депигментации раствора. Обесцвеченный раствор с колонки с анионитом ФАФ пропускают через колонку, содержащую набухщий в воде карбоксильный катионит КМТ в водородной форме при рНЛ-6, затем катионит КМТ промывают для удаления балластпых белков фосфатным буфером 0,,2 М при рН 5,8-6,0, после чего проводятэлюцию урокииазы при 5-10° фосфатным буфером с рН 7.

Пример 1. 10 л исходной мочи подщелачивают 1-3 М раствором КОН или NaOH до рН 7,5. Выпавший осадок отделяют, а полученный фильтрат подкисляют до 1 - 3 М раствором НС1 и пропускают через колонку 5,5X20 см, содержащую около 300 мл набухшего в воде анионита ФАФ в хлор - форме. Обесцвеченный раствор с колонки ФАФ цропускают для сорбции урокиназы через колонку 4,5X10 см, содержащую около 200 мл набухщего в воде карбоксильного катионита КМТ в водородной форме. Скорость пропускания раствора через ФАФ и КМТ составляет 100 мл/ч-см2. HQ окончании сорбции смолу КМТ промывают 3 л 0,05 М фосфатного буфера с рН 5,9 со скоростью 50 мл/ч см. После этого проводят элюцию урокиназы при 5-10°С с фосфатным буфером с Н 7,0 со скоростью 20 мл/ч см. Собранный элюат диализуют против дистиллированной воды и лиофилизуют. Выход составляет 300000 ед/л исходной мочи.

Пример 2. 10 л исходной мочи подщелачивают 1-3 М раствором КОН (или NaOH) до рН 8,0. Выпавший осадок отделяют, а полученный фильтрат подкисляют до рН 4,0 1-3 М раствором НС1 и пропускают через колонку 5,5X20 см, содержащую около 300мл набухшего в воде анионита ФАФ в хлор-форме. Обесцвеченный раствор с колонки ФАФ

пропускают для сорбции урокиназы через колонку 4,5X10 см, содержащую около 200 мл набухшего в воде карбоксильного катионита КМТ в водородной форме. Скорость пропускания раствора через ФАФ и КМТ составляет 100 мл/ч-см По окончании сорбции смолу КМТ промывают 3 л 0,1 М фосфатным буфером с рН 6,0 со скоростью 50 мл/ч-см. После этого проводят элюцию урокиназы при 5- 10°С фосфатным буфером с рН 6,7 со скоростью 20 мл/ч-см. Собранный элюат диализуют против дистиллированной воды и лиофилизуют. Выход составляет 650000 ед/л исходной мочи.

Пример 3. Юл исходной мочи подщелачивают 1-3 М раствором КОН (или NaOH) до рН 8,0. Выпавший осадок отделяют, а полученный фильтрат подкисляют до рН 4,8 1-3 М раствором НС1 и пропускают через колонку 5,5X20 см, содержащую около 300 мл набухшего в воде анионита ФАФ в хлор-форме. Обесцвеченный раствор с колонки ФАФ пропускают для сорбции урокиназы через колонку 4,5X10 см, содержащую около 200 мл набухшего в воде катионита КМТ в водородной форме. Скорость пропускания раствора через ФАФ и КМТ составляет 100 мл/ч-см По окончании сорбции смолу КМТ промывают 3 л 0,1 М фосфатным буфером с рН 6,0 со скоростью 50 мл/ч-см После этого прово дят элюцию урокиназы при 5-10° фосфатным буфером с рН 7,0 со скоростью 20 мл/чсм. Собранный элюат диализуют против дистиллированной воды и лиофилизуют. Выход составляет 2500000 ед/л исходной мочи.

Пример 4. 10 л исходной мочи подщелачивают 1-3 М раствором КОН (или NaOH) до рН 8,5. Выпавший осадок отделяют, а полученный фильтрат подкисляют до рН 5,7 1-3 М раствором HCI и пропускают через колонку 5,5X20 см, содержащую около 300 мл набухшего в воде аиионита ФАФ в хлор-форме. Обесцвеченный раствор с колонки ФАФ пропускают для сорбции урокиназы через колонку 4,5X10 см, содержащую около 200 мл набухшего в воде катионита КМТ в водородной форме. Скорость пропускания раствора через ФАФ и КМТ составляет 100 мл/ч-см. По окончании сорбции смолу КМТ промывают 3 л 0,1 М фосфатного буфера с рН 6,0 со скоростью 50 мл/ч-см. После этого проводят элюцию урокиназы при 5-10° фосфатным буфером с рН 7,5 со скоростью 20 мл/ч-см. Собранный элюат диализуют против дистиллированной воды и лиофилизуют. Выход составляет 1200000 ед/л исходной мочи.

Предлагаемый способ выделения фермента тромболитического действия технологичен, прост и эффективен при получении урокиназы и позволяет получать полностью очищенный от пигментов исходного раствора препарат с одновременным снижением его стоимости, имеющей удельную активность 35000 ед/мг препарата.

Формула изобретения

Способ выделения фермента тромболитического действия, включающий очистку исходного раствора от примесей, пропускание раствора через колонку с анионитом ФАФ в хлорформе для депигментации раствора, пропускание депигментированного раствора через карбоксильный катионит КМТ в водородной форме при рН 4-6, промывку катионита для удаления балластных белков и элюцию фермента фосфатным буфером, отличающийс я тем, что, с целью снижения стоимости фермента и упрощения способа при получении урокиназы, в качестве исходного раствора используют мочу людей, его очистку от примесей осуществляют путем введения едкой щелочи до рН 7,5-8,0, очищенный раствор подкисляют перед пропусканием через колонку с анионитом ФАФ до рН 3,5-5,7, а промывку катионита КМТ осуществляют фосфатным буфером 0,05-0,2 М при рН 5,8-6,0.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1.Зубаиров Д. М., Асадуллин М. Т., Зинкевич О. Д., Ченбосирова Г. Ш., Тимербаев В. Н. «Выделение и некоторые свойства урокиназы человека. Биохимия, 39, вып. 2, 1974, с. 373.

2.Патент Англии № 802326, кл. 2/3/N, опублик. 1958.

Самсонов Г. В., Селезнева А. А., Пономарева Р. Б., Шатаева Л. К., Орлиевская О. В., Козлова Т. А. «Ферменты микроорганизмов, Пищепромиздат, М., 1973, с. 205-209.