Способ отделения гемо-железа от глобина Советский патент 1982 года по МПК G01N33/72 

(54) СПОСОБ ОТДЕЛЕНИЯ ГЕМО-ЖЕЛЕЗА ОТ ГЛОБИНА

1

Изобретение относится к гематологии и касается обработки жидкостей, содержащих составные компоненты крови.

HinecreH способ разделения гемоглобина крови, включающий поэтапную обработку раС 5 твора, содержащего гемоглобин, солями и органическими растворителями {.

Однако ичиестный способ не обеспечивает высокого выхода и сохранения нативных свойств глобина.10

Цель и;юбретения - повышение выхода и сохранение нативных свойств глобина.

Поставленная цель достигается тем, что доводят рН исходного раствора до 2,5-4,5 затем обрабатывают его этанолом в концентра- IS vaiK 40-9 об.% и хлористым натрием, выпавщий в осадок гемин удаляют, а глобин осаждают из раствора и отделяют центрифугированием.

Способ осуществляют следующим образом. 20

Сначала отделяют часть железосодержащего компонента, которая существует в виде скопления в концентрированных растворах или сщсорПирусчся на прогеиновом компоненте: JIO oi.iijiciiiii ocvHioi ГРЛЯЮ1 посрепством цен- 25

трифугирования. Добавляют хлорид натрия, затем в образующемся верхнем слое происходит осаждение глобина путем добавления в этот слой вещества, способного увеличивать ионную силу или 1. обезвоживание в то время, как железосодержащий компонент остается в жидкой фазе в жидком нлн тонкодиспергированном состоянии.

Среда, создаваемая за счет высокого содержания растворителя, например этанола, и низкого содержания воды, с определенной ионной .силой и низкой величиной рН благоприятствует тому, что гемин и его производные, а также продукты его разложения в данной жидкости сохраняются в жидком или тонкодиспергированном состоянии, так что глобин можно отделять путем центрифугирования.

Пример1.К5г раствора гемоглобина с содержанием сухого вещества 15% и эт4нола 33% при -8° С добавляют по каплям при одновременном перемещивании и охлаждении смесь 1,1 мл 1 М соляной кислоты и 5 мл воды. После этого добавления температура -7°С, рН 2,5. К этой смеси добавляют по каплям 80 мл 94%-ного этанола, охлаждая ее до -10°С. Глобин выпадает в осадок при добавлении к сме си 0,3 мл сульфата аммония в виде 20%-ного водного раствора и центрифугируют 10 мин при 8000 д. Поверхностный жидкостный слой имеет ярко-коричневый цвет, а выпавший осадок серого цвета. Этот осадок промывают в 85%-ном этаноле при -10°С и рН 3,1, затем центрифугируют, в результате чего получают 2.4г массы с содержанием сухого вещества 23%. Пример 2. В раствор 36 мл 94%-ного этанола, 6 мл воды и 0,55 мл 1 М соляной кислоты при -12°С вводят по каплям при одновременном помешивании и охлаждении 2.5г раствора гемоглобина, температура остается -12° С, рН 3,0. Затем к смеси добавляют 45 мл 94%-ного этанола и жидкость центрифугируют в течение 1 мин при 8000 д, получают густую массу в количестве 0,1 г. Глобин выпадает в осадок при добавлении 0,4 мл 20%-ного раствора сульфата аммония, рН доводят до 3,0, путем центрифугирования так же, как в примере 1, получают 45 г густой массы с содержанием сухого вещества 36%. Дальнейшее осаждение из поверхностного жидкого слоя осуществляют путем добавления 0,4 мл сульфата аммония, получают 9,40 г мае сы с содержанием сухого вещества 42%. Полученная густая масса светло-серого цвета, поверхностный слой ярко-коричневого цвета, не образует осадка при введении трихлоруксу ной кислоты. ПримерЗ.К раствору 20 мл 94%-ного этанола и 1,1 мл 1 М соляной кислоты при -15° С добавляют по каплям при одновременном перемешивании и охлаждении 5 г раствора гемоглобина, рН 2,9. Смесь центрифугирую при 27000 g в течение 20 мин, образуется черная густая масса в количестве 0,9 г с содержанием сухого вещества 8,3%. К поверхностному коричневому слою при перемешивании и охлаждении добавляют 50 мл 94%-ного этанола при , при добавлении 10 мл воды и 1,2 мл 20%-ного сульфата аммония вьшадает осадок. Осадок отделяют центрифугированием при 8000 9 в течение 10 мин и полученную густую массу суспендируют в 94%-ном этаноле при -15 С и снова отделяют центрифугированием при тех же условиях. Получают 1,6 г массы светло-серого цвета с содержанием сухого вещества 37,6%. Пример 4. К раствору 40 мл 94%-ного этанола и 1,1 мл 1М соляной кислоты при -15° С при перемешивании и охлаждении добавляют по каплям 5 г раствора гемоглобина, рН 2,0. К этой смеси добавляют по каплям 5 мл 20 кого хлорида натрия и жидкость центрк фугируют при 27000 g в течение 20 мин, получают 1,4 г черной густой массы с содержанием сухого вещества 11%. К этому поверхностному слою добавляют 12 мл воды и 1 мл 20%-ного раствора сульфата аммония, после чего жидкость центрифугируют при 8000 g в течение 10 мин. Получают серую массу в количестве 3,8 г с содержанием сухого вещества 14,6%. Пример5. К5мл раствора гемоглобина при -8°С добавляют по каплям при одновременном перемешивании и охлаждении смесь 11 мл воды, 4 мл этанола и 1 мл 1 М соляной кислоты, температура смеси -6°С. После добавления температура -4°С, рН 2,9. При добавлении 7 мл 0,1 М раствора гидрата окиси натрия рН 3,9. При добавлении 0,2 г сульфата аммония выпадает осадок в виде коричневой массы. Осадок отделяют центрифугированием при 300 д. Жидкую массу суспендируют несколько раз в небольших количествах 94%-ного этанола при рН 3,0 и температуре -12° С и отделяют центрнфугированием. Получают 3,05 г серой массы с содержанием сухого вещества 18,8%. Пример 6. Из 5г гемоглобинового раствора осаждают гемоглобин добавлением в этот раствор 10 мл 94%-ного этанола при перемешивании и осажде}ши при -6°С. Выпавший осадок отделяют центрифугированием в течение 5 мин при 2000 g, получают 6 г красной густой массы. На дне центрифуги образуется осадок черного цвета. Красную массу добавляют к -70 мл раствора 94%-ного этанола и 1,1 мл 1 М соляной кислоты при -12° С при перемешивании и охлаждении. После добавления рН раствора 2,9, температура -12°С. Смесь центрифугируют 10 мин при 27000 g, образуется небольшое количество черной массы. Невыпавший в осадок слой жидкости добавляют в 2 мл 40%-ного раствора сульфата аммония и 10. мл воды. Температура этой смеси составляет -8° С, рН 3,4. Вьшавший осадок отделяют центрифугированием в течение 10 мин при 800 д. Полу-, чают 1,5 г серой густой массы с содержанием сухого вещества 93,3%. П р и М е р 7. К 20 мл 94%тного раствора этанола и 1,1 мл 1 М соляной кислоты при , -12° С добавляют по каплям при перемешивании и охлаждении 5 г раствора гемоглобина. После добавления рН 2,9 температура -12°С. Полученную смесь кори шевато-черного цвета ентрифугируют в течение 10 мин при 27000 g, олучают 2,2 г черной массы с содержанием ухого вещества 2,7%; всплывая на поверхHocri., светло-коричневая жидкость приобретает гелеобра:1ную консистенцию. К невыпавшему в осадок жидком слою добавляют по каплям при перемешивании и охлаждении 70 мл холодного этанола, а затем 0,8 мл 40%-ного раствора сульфата аммония и 8 мл воды. После этого до.бавления температура составляет -6°С. Выпавший осадок отделяют центрнфугированием в течение 10 мин при 8000 д, полу чают 1,7 г белой густой массы с содержанием сухого вещества 36%. Предлагаемый способ обеспечивает высокий выход продукта с сохранением нативных свойств глобина. 6 Формула изобретения Способ отделения гемо-железа от глобина, включающий поэтапную обработку раствора, содержащего гемоглобин, солями и органическими растворителями, отлича-ющийс я тем, что, с целью повышения выхода и сохранения нативных свойств глобнна, доводят рН исходного раствора до 2,5-4,5, зат.ем обрабатывают его этанолом в концентра щш 40-91 об.% и хлористым натрием, выпавший в осадок гемин удаляют, а глобин осаждают иэ раствора и отделяют центрифугированием.® Источники информации, принятые во вниманне при экспертизе 1. Бреслер С. Е. Введение в молекулярную биологию. 1973, с. 130-131.