Способ получения полипептидов Советский патент 1981 года по МПК C07K7/06 A61K38/08 

Изобретение относится к способу получения новых полипептидов - биоло гимески-активных соединений, которые могут найти применение в медицине. Известны способы получения пептидов путем отщемпения защитных групп от соответствующих защищенных по аминогруппе пептидов. Использование известного метода позволяет получить новые пептиды, обладающие интересным фармакодинамическими свойствами TlJ. Цель изобретения - получение новых биологически-активных полипептидов, расширение арсенала средств воздейст вия на живой организм. Поставленная цель достигается способом получения полипептидов формулы A-B-Gly-D-, , (1) где А - остаток формулы где водород;., Rft- водород или вместе С К - СН2 -СН -группа; водород, алкил (Cj..-), алкенил (Cj-f) , циклопропилметил, цикпобутилметил или RjCO-, где Rj- остаток L-аминокислоты, L-аланин, L-глутамин, L-метионин, L-тирозин, L-триптофил, L-фенилаланин, L-метилтриптофил или RJ- L-метионинсульфоксид, L-метионинсульфои, 1-3,4 Диоксифенилаланин, причем свободные аминогруппы могут быть замещены алкилом (), причем, если В-О-аланин, RJне может быть фенилаланином или тирозином, О-аланин, О-серин, 0-метионин, D-метионинсульфоксид, D-метионинсульфон, остатокel-аминомаспяной кислоты (Aib); остаток формулы -ft.-CjH-COЦЦгде водород, или метил; - остаток формулы -N-CH-CH OH где RJ- водород . Rfc- а) -СН2.СН(СНз)г б) (п : tO)n в) RyBMecTB с iT-снk. , или при условии, что В - а) D-аланин, если Z (группа RijCO - и/или . R2 )Вместе- группа -CH2.,. причем остаток А имеет О-конфигурацию и/ил 1 -Н . .(0)Ъ 6)dl-аминомасляная кислота, есл R . и R вместе - группа - СН2.-СН2.и/или -CH2 -CHj -S-CH3 (г - 1,2) (OJr остатки А и О имеют конфигурацию L или DL-ряда g -конфигурацию L,D или DL-ряда, если R и Rj вместе означают группу - CHjfCHi-, А также может иметь D-конфигурацию, заключающимся в том,что защищенный полип тид с последовательностью аминокисл отвечающих формуле I,подвергают деб кированию в безводной кислой среде Предпочтительным вариантом спосо является использование в качестве лой среды трифторуксусной кислоты хлористом метилене. В приводимых ниже примерах приме нены следующие сокращения: Alb- остаток сА-аминомасляной ки лоты; Вое- трет.бутилоксикарбонильная группа; ДМФ - диметилформамид; Dopa - остаток 3 -диоксифенилая нина; Leu-0 - лейцинольный остаток; Met(0)-OB - остаток метионинсул фоксида; Met (05,) .- остаток метионинсульф Met-OB - метионинольный остаток Met(0)-0t - метионинолсульфокси ный остаток; MePhp - остаток N-метилфенилала на;. 54 МеТгр - остаток f-мeтилтpиптoфaнa; MeYyr - остаток N-метилтирозина; ONp - 4-нитрофенокси-группа; Рго-ОЕ - пролинольный остаток; ,, ТФУ ,- трифторуксусная кислота;. ThZ-OB-4--i - оксиметилтиазолидинильный-3 остаток; ThZ(0)-OB- -оксиметилтиазолиди нилсульфоксильный-3 остаток. Если нет дополнительных указаний, все остатки аминокислот, кроме остатка глицина, и все остатки аминоспиртов имеют L-.конфигурацию. Аминоспирты принадлежат L-ряду в том случае, когда их - группа занимает положение альфа - СООН - группы в соответствующей L-аминокислоте. Пример 1. Н-Туг-D-Met-GlyMePhe-Met-OI(трифторацетат). 7,5 г Boc-Tyr-D-Met-Gly-MePheMet-01 растворяют при комнатной температуре в 100 мл смеси трифторуксус-. ной кислоты и хлористого метилена, взятых в соотношении 1:1. Через 5 мин раствор упаривают в вакууме и производят осаждение продукта диэтиловым )эфиром. Получают указанное соединение, температура разложения которого - ( о1 ) -t,° (с 1,2 в уксусной кислоте, ), Примененный в качестве исходного материала Boc-Tyr-D-Met-Gly-MePhe-Met-OB получают следующим способом. а)Boc-D-Met-Gly-OH. К 37 г Boc-D-Met-ONp в 150 мл 1,2-диметоксиэтана прибавляют при комнатной температуре раствор 9 г глицина и 4,8 г гидроокиси натрия в 35,f воды. Через 2 ч реакционную смесь разбавляют 300 мл воды и продукт несколько раз экстрагируют этиловым эфиром уксусной кислоты. Водную фазу покрывают этиловым эфиром уксусной кислоты и подкисляют k н. раствором серной кислоты. Органическую фазу несколько раз.промывают разбавленным раствором кислого сернокислого калия и водой, после чего отгоняют растворитель в вакууме. Остатрк кристаллизуют из смеси этилового эфира уксусной кислоты и петролейного эфира. Температура плавления продукта 26°C, (ci.)JO + (с 1,1 в диметилформамиде), б)Boc-Tyr-D-Met-G1y-OH. К г Boc-Tyr-ONp, растворенным в АО мг диметилформамида, добавляют при комнатной температуре растворj содержащий в 40 мл диметилформамида

3,8 г H-D-Met-Gly-OH (трифторацетат), который предварительно получают из Boc-D-Met-Gjy-OH посредством обработки последнего смесью трифторуксусной кислоты и хлористого метилена, взятых в соотношении 1:1, и 3,3 мл триэтиламина. Через 2 ч раствор упаривают в вакууме, полученный остаток разбавляют 150 мл воды и производят обработку реакционной смеси так, как описано в пункте а. Указанное соединение крис таллизуют из смеси этилового спирта и петролейного эфира. Температура разложения продукта 195C;(oi- )г +11,6(с 1 ,0 в диметилформамиде),

с) Boc-MePhe-Met-OE.

Раствор 3,1 г Boc-MePhe-OH в З&мл тетрагидрофурана охлаждают до -20С при перемешисании добавляют к нему 1,5 мл N-этилморфолина, затем добавляют 1 , мл изобутилового эфира хлормуравьиной кислоты, после чего продолжают перемешивание реакционной смеси в течение 5 мин при -20С. Зате к реакционной смеси прибавляют охлажденный раствор 1,80 г метионинола в 8 мл тетрагидрофурана и реакционную массу выдерживают в течение 2 ч при температуре от -5 до 0°С, после чего перемешивание продолжают в течение 2 ч при комнатной температуре.. Непосредственно после этого реакционную массу разбавляют - 350 мл этилового эфира уксусной кислоты, раствор несколько раз промывают водой,.1 н. лимонной кислоты, раствором кислого углекислого калия, 30%-ным раствором хлористого натрия. Затем органическую фазу сушат сернокислым натрием, упаривают раствор, получают Boc-MePhe-Met-OE в виде аморфного продукта; ( oL )|° (с 1,2 в метиловом спирте).

б) H-MePhe-Met-OE (трифторацетат).

Раствор i,3 г Boc-MePhe-Met-0 в 20 мл хлористого метилена, 5 мл CHj-S-CH/ji -CHi, и О ,2 мл HS-CH2.-CHi-OH смешивают при с 40мл 981-ный трифтор уксусной кислоты. Реакционную смесь выдерживают в течение 1,5 ч при комнатной температуре, затем упаривают в вакууме до 5-10 мл. Продукт дважды переосаждают из смеси диэтилового и петролейного эфиров. Маслообразный продукт сушат в глубоком вакууме.Получают H-MePhe-Met-OE (трифторацетат) в виде аморфного продукта; ,(d- )р + 3,2. (с 0,98 в метиловом спирте).

е) Boc-Tyr-D-Met-Gly-MePhe-Met-OE.

К А,7 г Boc-Tyr-D-Met-Gly-OH, 2,7 г 1-оксибензотриазола, 4,1 г H-MePhe-Met-01 (трифторацетат) и 1,1 мл М-мет.илморфолина в tO мл диметилформамида Ърибавляют при , 2 ,3 г дициклoгeкcилкapбoд г «(lдa.Реакционную смесь выдерживают в течение

Iч при и в течение 15 ч при конатной температуре, осадок отфильтровывают, фильтрат упаривают в вакууме полученный остаток растворяют в этиловом эфире уксусной кислоты и раствор несколько раз промывают разбавленным раствором кислого углекислого калия, соляной кислотой и водой,посл чего растворитель отгоняют в вакууме Полученный остаток чистят с помощью хроматографии на колонке, заполненно силикагелем, используя для элюирования смесь хлористого метилена и метилового спирта. Получают указанное соединение в виде аморфного продукта ( )|f - 23,3 (с 1 ,2 в диметил- , формамиде). .

Пример 2. H-Tyr-D-Mer(O)-G1y-MePhe-Met(О)-ОЕ (трифторацетат)

7,9 г Boc-Tyr-D-Met(0)-G1yMePhe-Met(0)-01 растворяют при 22С в 100 мл смеси трифторуксусной кислоты и хлористого метилена, взятых в соотношении 1:1. Через 5 мин раствор упаривают в вакууме и осаждают указанное соединение диэтиловым эфиром; (t)J° -3,1 (с 1 в уксусной кислоте).

Примененный в качестве исходного материала Boc-Tyr-D-Met(О)-Gly-MePheMet(0)-OI получают следующим способом.

К раствору 7 ,5 г Boc-Tyr-D-MetG1y-MePhe-Met-01 в 75 мл уксусной кислоты при 22°С прибавляют 2 ,0 мл

IIМ перекиси водорода. Через 5 мин реакционную смесь вводят при перемешивании в 1 ,5 л диэтилового эфира и отделяют выделившийся в осадок неочищенный продукт фильтрованием. Неочищенный продукт чистят с помощью хроматографии на силикагеле, используя для элюирования смесь метилового спирта и хлористого метилена. Указанное в заголовке соединение получают

в аморфной форме, причем продукт тотчас подвергают обработке трифторуксусной кислотой.

По аналогиии с приведенными примерами, при использовании соответствующих исходных соединений, получают пептиды, указанные в табл. 1 и 2.

Соединение формулы A-B-Gly-0-E

Таблица 1

Соединение формулы НО

Таблица 2

CO-D-Ala-GIy-MePhe-Met(0)-01 (D-форма)

2ЦН .

25СН,-О; Формула изобретения 1. Способ получения полипептидов формулы 1 A-B-G1y-D-e где А - остаток формулы М R. но -/Q cHf - с - со - водород; водород или вместе с R/ -CH(jjCH|j-группа; водород, алкил (СУг), алкенил ). Циклопропилметил циклобутилметил или , где RJ- остаток L-аминокислоты: L-аланин, L-глутамин L-метионин, L-тирозин, L-тр птофил, L-фенилаланин, L-метилтрифтопил или Rj- L-метио нинсульфоксид, L-метионинсу фон, L-3 , -Диоксифенилаяани причем свободные аминогруппы могут быть замещены алкилом ( , причем В - D-аланин, RI не может быть фенилалани ном или тирозином; В - О-аланин, О-серин, D-метион D-метионинсульфоксид, О-мет нинсульфон, остаток е) -амино масляной кислоты (Aib) D - остаток формулы-Н-СН-00 где R4.- водород или метилу - остаток формулы

ТФУ -35,7

t,1 НС1 -18,9 0,55 -N-СН -CHnOW fe 5 где RJ- водород; Rfe- а) -СН2;СН (,2) СНлСплS (Oh в) Rj вместе с R -N -N - у1 (Ь о или 1) при.условии, что в а) D-Ala, если Z - группа RjCO- и/или R-уи Rj вместе - группа - , причем А имеет D-конфигурацию и/или i |Ы СН2рН ,-N YT СН,ОН( 1) 1 )b б) Alb, если R и KI вместе - группа и/или g -CHrt-CHftS-CHj . (0)г (г 1,2); остатки А и D имеют конфигурацию L или DL-ряда-, g: -конфигурацию L,D или DL-ряда, если Ri вместе означают -CHQ -CHQ -группу, А также может иметь D-конфигурацию, отличающийся тем, что, замещенный полипептид с последовательностью аминокислот, отвечающих ормуле I, подвергают деблокированию безводной кислой среде. 2. Способ по п,1, отличающий с я тем, что в качестве безводной кислой среды используют трифторуксусную кислоту в хлористом метилене. Приоритет по признакам: 16,05.77 при А - R, все указанные значения; Z , где L-аланин, L-г тамин, L-метионин, L-триптофил L -фенилаланин; В - D-метионин, D-метионинсуль фоксид, D-метионинсульфон; D - R4.-водород, метил; е - В5 водород, Rg,-CH(CH(CH3, , где n 1 или 2. 16.06,77 при А - все указанные значения; Z - , где Rg - L-аланин, L-глутамин, L-метионин, L-триптофи L-фенилаланин, L-метионинсульфокси L-метиони нсул ьфон; В - D-аланин, D -.водород, метил; - RJ-водород, Rg-CH CHCCHj), .S -СН 3 , где n 1 или 2. 20.06.77 при А Z - во род; В D-метионин, О-метионинсуль фоксид; D - RA-метил; . - L-метионин, L-метионинсуль сид. 21.06.77 при А - R,R -все ука занные значения; Z - водород, алкил (), алк нил (Cj-Cj), циклопропилметил, цик бутилметил, или группа , где Ra-остаток L-аминокислоты. аланин 12 лутамин, метионин, триптофил, фенилланйн, метионинсульфоксид, метионинульфон;В - О-аланин, D-метионин, О.-меионинсульфоксид, D-метионинсульфон; D - R вoдopoд6, метил; - . и , вместе означают , -N -СН- ( или 1) -NСН(0)6. . 21.06.77 при А- R,Ri2- все указанные значения; Z - RoCO, где Rj L-аминокислота: аланин, глутамин, метионин, триптофил; фенилаланин, метионинсульфоксид,метионинсульфон или 3 ,1-ДИоксифенилаланин, свободные аминогруппы в остатке Rj могут быть замещены алкилом (C-f-.) 23.06.77 при А - R/|И Rj, вместе , А имеет D-конфигурацию; Z - все указанные значения; В - D-аланин, D-метионин, D-метионинсульфоксид, D-метионинсульфон; D - все указанные значения; - все указанные значения. 1M.11.77 при A,D,g. - все указанные значения; В - D-серин. Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1. Шредер Э. , Любке К. Пептиды, М. , Мир, 1967, Ч.1, с. 112.