Способ количественного определения антител к коллагену Советский патент 1982 года по МПК G01N33/56 G01N33/80 

1

Изобретение относится к медицине, а именно иммунологии, и может быть использовано для анализа иммунологических препаратов.Известно определение количества антител (АТ) к коллагену радиоиммунологическим методом, заключающееся в том, что к исследуемому раствору добавляют меченный радиоактивным изотопом коллаген и образовавшиеся в ходе иммунологической реакции нерастворимые комплексы антиген-антитело (АГ-АТ) отделяют соосаждением с помощью независимой дополнительной системы АГ-АТ, которая образует обильный преципитат. После серии отмывок осадка определяют количество антител в исследуемом растворе по преципитировавшей радиоактивности с помощью калибровочной кривой D

Основным недостатком этого метода является методологическая сложность. Кроме того, процесс маркирования коллагена связан с использованием большого количества изотопа.

Цель изобретения - упрощение способа.

Для достижения поставленной цели согласно способу определения антител к коллагену, включающему постановку, серологической реакции с исследуемым раствором и последующее измерение преципитирующей радиоактивности,

10 предварительно проводят адсорбцию коллагена на полихлорвиниловую поверхность в буферном растворе при рН 9,0-10,0 и температуре 30-37,5°С в течение 2-6 ч, затем на полихлорtsвинйловую поверхность наносят исследуемый раствор и связавшиеся при этом антитела детектируют вторыми 11Ь-|-антителами к иммуноглобулинам животного - продуцента антител к кол20лагену.

Пример 1. Для адсорбции коллагена на полихлорвиниловую поверхность готовят раствор коллагена 1 типа быка в буферном растворе с рН 9 10. Раствор наносят на полихлорвиниловую поверхность, выполненную в виде лунки, и .выдерживают 2-6 ч при 30-37,. Избыток коллагена удаляют при промывке лунок. Исследуемый раствор антител в буфере в различных разведениях вносят в лунки, AT прочно связываются с адсорбированным на полихлорвиниле коллагеном, все остальные компоненты исследуемого раст . вора удаляются при промывке.Оставшиеся в лунке не смытые иммуноглобулины (т.е. антитела) детектируются вторыми меченными 5 з антителами к иммуноглобулинам животного |продуцента ЛТ к коллагену. Избыток вторых AT удаляют промыванием. Количество AT к коллагену определяется по калибровочной кривой, исходя из количества радиоактивности, специфически связавшейся в лунке. На чертеже представлена калибровочная кривая. Построение калибровочной кривой отличается тем, что в качестве иссле дуемого берут препарат чистых антител к коллагену 1 типа известной концентрации. Пример 2. А. Получение твер дой фазы. В лунку из полихлорвинила вносят 100 мл раствора коллагена 1 типа быка (17 мкг/мл) в 0,01 М карбонатно буфере рН и инкубируют 2 ч при и ночь при с. Затем промывают 10 раз холодной водопроводной водой. В каждую лунку вносят по-200 мкл 10%-ной нормальной лошадиной сыворот ки в фосфорном буфере рН 7,0 (0,15М КН,2.Р04 0,075М NaCJ + + 0,02% NaN3+ 0,05% ТВИН-20), инкубируют 2 ч при комнатной температуре 5 раз промывают %-ной нормальной лошадиной сывороткой. Б.Определение количества антител к коллагену. В лунки из полихлорвинила с адсорбированным на них.коллагеном 1 ти па быка вносят по 10.6 мкл различных разведений в фосфатном буфере рН 7fO исследуемых растворов, содержащих AT кролика к коллагену 1 типа быка. Инкубируют ч при комнатной темпера туре, промывают проточной водой и вносят 50 мкл раствора вторых, меченных З -антител барана к иммуно глобулинамкролика 30.000 имп/мин на лунку в фосфатном буфере рН 7,0 Инкубируют ночь при , промывают проточной водой, вырезают лунки и просчитывают радиоактивность на гамма-счетчике. Количество AT кролика к коллагену 1 типа быка в исследуемом растворе определяют по калибровочной кривой, исходя из связавшегося с лункой количества радиоактивности. Для определения уровня неспецифического связывания в каждом эксперименте в качестве одного из исследуемых растворов используют нормальную сыворотку кролика, инактивированную при ЗО мин. Для построения калибровочной кривой в качестве исследуемого раствора берут раствор чистых антител кролика известной концентрации к коллагену 1 типа быка. Для разведенного в 20, 200 и 10000 раз исследуемого образца получаем соответственно 19,250, 10290 и 600 имп/мин. Исходя из внесенного количества радиоактивности 50000 имп/мин, вычисляют процент связывания радиоактивной метки с твердой фазой,равный 35,5; 20,6 и 1,12 соответственно. Количество антител в исследуемом образце определяют по калибровочной кривой, исходя из процента связывания метки и учитывая разведения. Проценты связывания, полученные для разведений 1:20 и 1:10000., лежат вне калибровочной кривой и поэтому непригодны для определения количества антител. Величина 2С,6% лежит на рабочем участке калибровочной кривой и вполне пригодна для вычисления по ней количества антител. Исходя из этрго и используя данные для разведения исследуемого раствора в 200 раз, получаем, что в 50 мкл этого разведения исследуемого раствора содержится 9,0 нг антител, а их концентрация составляет 36,0 мкг/мл. Пример 3- Все условия осуществления способа по примеру 1, за исключением того, что в качестве исследуемого образца используют раствор антител к коллагену 1 типа быка с исходной концентрацией 1,1 мг/мл. Исходный раствор разводят в 4000 и 20000 раз. Процент связавшейся радиоактивности оказался равным 25, и 8,3 соответственно. Определенная по калибровочной кривой концентрация исходного раствора составляет 1,13 мг/мл и 1,04 мг/мл соответственно.

Из примеров видно, что предлагаемый способ позволяет получить резуль тат с точностью Ц%, что вполне удовлетворяет требованиям, предъявляемым к подобным способам в биохимии. Предлагаемый способ сравним по точности определения с известным жидкофазным радиоиммунологическим способом определения количества антител к коллагену и в то же время является значительно более простым.

Предлагаемый способ определения AT и коллагену 1 типа является высокочувствительным, точным, воспроизводимым, высокоспецифичным, простым, технически удобным, высокопроизводительным и не требует работы с большими количествами радиоактивности. Чувствительность метода 510 нг белка антител в мл (0,25-0,5 нг AT в 50 мкл- пробы). Специфическое связывание вторых AT составляет 3Q k(% от вносимой дозы, а неспецифическое 0, Специфическое связывание подавляется в присутствии р аство римого коллагена 1 типа быка. I Предлагаемый способ позволяет детектировать ЛТ к коллагену 1 типа в любых физиологических растворах. Использование малых доз радиоактивности делает его практически полностью безопасным, не требуется также никакого вспомогательного сложного оборудования. Полностью подготовленные для определения радиоактивности пробы могут храниться в любых. условиях, а при использовании пересчета на распад изотопа - практичес ки неограниченно долго.

Формула изобретения

Способ количественного определения антител к коллагену, включающий постановку серологической реакции с исследуемым раствором и последующее измерение преципйтирующей радиоактивности, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа, предварительно проводят адсорбцию коллагена на полихлорвиниловую поверхность в буферном растворе при рН 9,0-10,0 и температуре 30-37,5°С в течение 2-6 ч, затем на полихлорвиниловую поверхность наносят исследуемый раствор и связавшиеся при это антитела детектируют вторыми llSj -антителами к иммуноглобулинам животного - продуцента антител к коллагену.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе I.Menzel J. Radloirmnunoassay for anticoMagen antibodies usfngP Cj Labelled collagen. J. Immunol. Meth. 1977, It, p. 77-Я.

t W

I

i

5 w го

fo w Ш wa

ЛГ.

Тунг8 nynKt