Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS L, используемый для получения моноклональных антител к человеческому коллагену IY типа Советский патент 1990 года по МПК C12N5/00 

Изобретение относится к гибридом- ной технологии и может быть использовано в меди1щне и биологии.

Цель изобретения - получение штамма гибридных культивируемых клеток животных MUS musculus L, продуцирующего моноклональные антитела к человеческому коллагену IV типа.

Штамм получают следующим образом.

Мышей линии BALB/C иммунизируют подкожно введением 50 мкг человеческого коллагена IV типа в 0,5 мл полного адьюванта Фрейнда. .Через 10 и 20 дней после первого введения провод

дят дополнительные иммунизации аналогичным образом. Через 3 дня после последней иммунизаи 1и иммунных мкпией -забивают, 15x10 клеток селезенки гиб- ридизуют с 5x10 клеток миеломы мыши X63.P3/Ag.8.653 в течение 1 мин в г . присутствии 0,7 мл раствора, содержащего 50% (по объему) полиэтиленглико- ла (ЦЭГ) мол.массы 1000 и 15% диметнл сульфоксида. Цосле гибридизации и отмывки клеток средой DMEM от ЦЭГ клетки высевают в 96-луноч}1ые панели по 1x10 клеток в лунку. Для культивирования и селекции гибридов используют

О5

о ю

00

о о

3160

среду DMEM с добавлением 29% эмбриональной коровьей сыворотки, 2 мМ L- глутамина, 10 мМ пирувата на ГЕрия-,, 100 мкг/мл канамицина, 5 м аЕЧ}4нл зона 0,05 мМ 2-меркаптоэтая:сща,.. 0„ гидрокарбоната натрия, 100 мйй иипо- ксантина, 0,4 мкК аминоптерияз, мМ тимидина в атмосфере 5% ур-1твКиез1,о:го газа при 37 С.

Гибриды отбирают по спасюйюэзе ш продуцировать антитела к тк актека, Отобранные гибриды двалд ы ЩЕешвщааш методом конечных разведений. повторного клонирования пражфийееки 100% субклонов продуцируют ая т-итела к коллагенам. Продукция эт-и-х антител сохраняется, по крайней мере, до 50 пассажа.

Условное наименование штамма НС4.

Условное наименование ан Твйг.егь, синтезируемых штаммом НС4, РмСА, .

Штамм депан ирован во В&ет эюзяой коллекции клеточных культзФ шщ .н-апо- ром ВСКК(П) № и ка рале-11@ри уеФся следующими свойствами.

Культуральные свойства. Культивирование гибридных клеток НС4 проводят в пластиковых флаконах. Посевная доза 100 тыс. клеток в 1 мл плотность в монослое 1x10 клеток/мл Культуру пассируют как суспензионную в дозе 100 тыс.клеток в 1 мл 1 раз в 5 дней или в дозе более lOO тыс„клеток в 1 мл 1 раз в 3 дня. Через 3-4 дня в культуральной среде можно обнаружить моноклон ал ьные антитела к коллагену, концентрация которых составляет 1-10 мг/мл в зависимести от посевной дозы.

Клетки штамма НС4 культив и;р.у ЮТ также в организме животных. Ингажтньда Мышам линии BALB/C -за 10 дней до инъе-к- ции штамма вводят внутрибрюшннмо (в/бр) по 0,5 мл пристана. Ш1гамм инъ- ецируют в/бр. по (1-5) X 10 israeTOK в 1 мл среды Игла. Асцит образуемся че- .рез 8-.12 дней. Концентрация аштшфела в асцитной жидкости 10-30 мг/мя.. Возможна, по крайней мере, дву ёршрша я перевивка штамма с сохранедвем продукции антител.

Стандартные условия кульдаетярова- ния. Среда DMEM с бикарбонатом и 20% телячьей эмбриональной сыворотки, 2 м L-глутамина, 2 мМ пирувата натрия, 100 мкг/мл канамицина, 5 мкг/мл фун- гизона, 0,05 мМ 2-7меркапт0эФая«ла пр .37°С в атмосфере 5% углекислого газа

0

0

5

л

5

40

45

50

Хара ктеристика полезного продукта штамма. ЫФамм продуцирует монрклог- нальные аититела - иммуноглобулины мыши класса К. Эти антитела специфически связываются с человеческими коллагеном IV типа, с незначительной пе- рекр.естной реакцией с коллагеном Г типа. В пределах чувствительности ис- польз.ова«ных ме тодов не обнаружено связьшаН йе с человеческими альбумином, .инчэр©Н ОМ, фибронектином и коллаге нами IM. и V типов. Присутствие плазмы кf)J©ви №& влияет на взаимодействие мон окло нальных антител с человеческим к-оллаге«0м IV типа.

КлетК И штамм-а консервируют по 1 х X 10 клеток/мл сыворотки крупного рогатого скота с добавлением 10% ди- метилсульфоксида в пластиковых ампулах. Замораживание ампул проводят в коробке из вспененного полистирола с толщиной стенок 1 см. Коробку с ампулами оставляют при -70°С. и через 1 сут пере-нося-т ампулы в жидкий азот для хфа-н-ения.

Размораживание проводят быстро в водяной бане при . Жизнеспособность после размораживания, оцениваемая по включению трипанойого синего, составляет не менее 60%.

Контаминацию бактериями и грибами в культуре не обнаруживают при длительном наблюдении и при посевах на питательные среды. Заражение микоплаз мами не выявлено методом гибридизации клеточной ДНК с универсальным диагностическим зондом (плазмидой PMG16), содержа.щим фрагмент рибосомного гена, общего для всех видов микоплазм.

Пример 1. Определение связывания антител АмС4 с коллагенами I, III, IV и V типов, фибриногеном, альбумином и фибронектином человека.

№а дно ячеек 96-ячеечной полистироловой панели сорбируют белки, с которыми определяли связывание антител. Для этого в ячейки вносят по 50 мкл раствора белка с концентрацией 1-0 м кг/м-л в 200 мМ бикарбонатном буферном растворе, рН 9,0 и оставляют на 1-6 ч при . После пятикратной промывки з-абуфе:ренным физиологическ раствором (ЭФРТУ, содержащим 5 мМ NaHjF04, 140 мМ NaCl, 0,05% твина 20, рН 7,4, в ячейки вносят по 50 мкл культуральной среды от штамма НС4 или р аствора ЭФРТ, содержащих могоклональ- ное антитело АмС4 в различной концентрации, и инкубируют 30 мин при . Несвязавпшеся антитела отмывают ЭФРТ 5 раз, в ячейки вносят ковалентно связанные с пероксидазой хрена антитела кролика против иммуноглобулинов мыши с концентрацией 5 мкг/мл в ,50 мкл раствора ЗФРТ. Через 30 мин инкубации при нecвязaвшIiecя антитела от мывают указанным выше способом, а количество оставшейся в ячейках перок- сидазы, пропорциональное количеству молекул антител АмСА, определяют количественно по расщеплению субстрата для пероксидазы (HjOj) в присутствии хромогена - ортофенилендиамина. Реакцию останавливают добавлением 50%-ной серной кислоты до конечной концентра- ции 5%.

Положительная реакция проявляется изменением окрашивания от желтого до коричневого и просчитывается на спектрофотометре при длине волны 490 им.

Результаты примера 1 свидетельствуют о высокой специфичности взаимодействия антител с коллагеном IV типа в диапазоне исследопанных концентраций. Наличие некоторой перекр СТ 1ой реакции с коллагеном 1 тигга не может служить препятствием при использовании антител АмС4 для выявления багзаль- ной мембраны ввиду отсу,тстиия is ба- зальной мембране коллагена 1 типа.

И.р и м е р 2, Определение спязы- вания антител АмСА с человечрск)1м кол лагеном IV типа в присутствии плазмы крови человека.

Антитела АмСА инкубируют в плазме крови или в ЭФРТ 30 мин при 37°С и

затем добавляют к коллагену. Дальней шие определения проводят аналогично описанным в примере 1,

Из данных примера 2.следует, что присутствие плазмы крови, по сравнению с раствором ЭФРТ, не изменяет свя- зьгоания исследуемых антител с коллагеном IV типа.

Результаты приведенных примеров однозначно свидетельствуют о высокой специфичности моноклонального антитела АмСА, вырабатываемого штаммом НСА, и показывают: возможность использования указанных антител для типирования опухолей, выявления мест инвазии опухолевых клеток .в стенках сосудов; для исследования синтеза и экспрессии колг лагена IV типа различными клетками человека при культивирова П1и их in vitro; для изучения распределе1гия коллагена IV типа в различных органах и тканях человека в иммуногистологичес- ких исследованиях, как в норме, так и при патологии.

Таким образом, предлагаемое моно- клона;п ное антитело имеет большое практическое значение и может быть использовано и самом широком круге задач, спяланных с проблемами биологии и медицины.

Формула изобретения

5

0

5

0

Штамм гибридных культивируемых кле- 35 ток ЖИ1ЮТНЫХ Mas miisculus L. BCKK(II) N 16AI), используемый для получения моноклонал1)Ных антител к человеческому коллагену IV типа.

Изобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано в медицине и биологии. Целью изобретения является получение штамма гибридных культивируемых клеток животных MUS MUSCULUS L, продуцирующего моноклональные антитела к человеческому коллагену IY типа. Штамм получают гибридизацией клеток селезенки мыши линии BALB/C, иммунизированной человеческим коллагеном IY типа, с клетками миеломы мыши Х63.Р3/Ад 8.653. Штамм депонирован под номером ВСКК(П) 164Д. Гибридому культивируют в среде ДМЕМ с бикарбонатом и 20% телячьей эмбриональной сывороткой, 24 мМ L-глутамина, 2 мМ пирувата натрия, 100 мкг/мл канамицина, 5 мкг/мл фунгизона, 0,05 мМ 2-меркаптоэтанола при 37°С в атмосфере 5% CO₂. Штамм продуцирует моноклональные антитела класса I дМ, которые специфически связываются с человеческим коллагеном IY типа. На 3-4 день культивирования концентрация моноклональных антител составляет 1-10 мг/мл в культуральной жидкости и при культивировании в организме животного в асците - 10-30 мг/мл.