Способ определения хемилюминесценции плазмы и сыворотки крови Советский патент 1982 года по МПК G01N33/16 

(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ХЕМИЛЮМИНЕСЦЕНЦИИ ПЛАЗМЫ И СЫВОРОТКИ КРОВИ

1

Изобретение относятся к медицине, а именво к способам диагностики различных заболеваний.

Известен способ определения хемшиоMHBecneJBtOHH ттаэмы и сыворотки крови Путем добавления двухвалентного железа в регвстрацвв вспышки свечения 1 .

Однако известный способ недостато во точен вследствие наличия в образцах крови в различной выраженного гемолиза.

Цель изобретения - повышение точности метода путем устранения влияния гемолиза.

Поставленная asm, достигается тем, Ято йрн осуществлении способа опреде- Пввиа хемвлюминесценпии плазмы и (;ы)вороткя крсюи путем добавления двухва- jneHTBoro железа и регистрации вспышки Ьквчввха, сыворотку или плазму крови . преоваригельно обрабатывают расгворами Хпорвстого кальция в кристаллического геалряав и выделяют липопротеиды низкЛ плотности.

Способ осуществляют следующим образом.

Образны плазмы и сыворотки крови предварительно обрабатътают 0,1 - 4,0 мл 0,05 - О,8%-ного раствора хлористого кальция и О,О1-О,8мл 0,1-1р%-ного раствора гепарина в зависимости от вида животного с последующим выделением липопротеидов низкой плотности.

to

Пример. Берут сьторотку крови в количестве 0,2 мл (донор мужчина 26 лет), добавляют 2мл 0,28%-ного раствора хлористого кальция и 0,04 мл 1%-ного раствора кристаллического парина. Полученный раствор инкубируют в течение 4 мин, и затем центрифугируют 5 мин при ЗООО об/мин. Супернатант удалшот, к осадку прибавляют 1 мл О,85% ного раствора хлористого натрия и поме20щают в кювету хемилюминесцентной установки для исследования. К полученной суспензии липопротеидов низкой плотности добавляют 8 мл 120 мМ фосфатного буфера, рН 7,4, и 1 мл 25 мМ раствора двухвалентного железа. Всхзникает Bcttbrnma хемилюмннесвениии. Оптическая плотность при 440 им составляет 0,28 (для исходной сыворот ки крови). Параметры вспышки ришшрованноб двухвалентным, железом хемюпоми несценпии 0,2 мл сьгооротки крови равны 5 42,5 усл. ед., ti 17,5 усл. ед., I; 25с НИ уел, ед., соогаетственно хемилюмннеспенпия лилопротеидов низкой плотности из О,2 мл сыворотки крови: 5 205,5ус ед.,11 27 усл. ед., i 50 с, Н 26 усл.ед После искусственно вызванного гипотонического гемолиза оптическая плотность сыворотки крови увеличилась до 2,25, Параметры вспышки инициированной двухвалентным железом хемилюнесцендии 0,2 мл сыворотки изменились следующим образом (в скобках процентное выражекие относительно исходных значений) : S 28,5 усл. ед (67%), 1) 15,5 усл. ед. (89%), i 60 с (240%), Н 9 усл. ед. (82%), соответственно хемилюминесцанция липопротеидов низкой плотности из О,2 мл сыворотки крови: 5 119 усл. ед. (8О%), -Ь 24 усл.ед. (89%), t 40 с (80%), Н 19,5 усл. ед. (75%). П р и м е р 2. Берут сыворотку крови больного первичным билиарным цирро- эом печени (мужчина 29 лет), к 0,2 мл которой добавляют 2 мл О,28%-ного раст вора хлористого кальция и 0,04 мл 1%-н го раствора кристаллического гепарина. Полученный раствор инкубируют 4 и затем дантрифугируют 5 мнн при ЗООО об/мин. Супернатант удал5Пот, к осадку добавляют 1 мл 0,85%-ного раствора хлорйсто го натрия и помещают в кювету хемилю инесцентной установки, куда добавляют также 8 мл 120 мМ фосфатного буфера рН 7,4. К полученной суспензии лнпопротеидов низкой плотности добавляют 1 мл 25 мМ раствора двухвалентного железа (FeS04 7 Hjp). Возникает вспышка , Хемилюминесценшш. Оптическая плотност сыворотки крови при .440 нм составляет 0,13. Параметры вспышки инициированной двухвалентным железом хемюпоминес шнпвв 1 мл сыворотки крови равны : 9 9 усл.ед., V 15 усл.ед., -fe 175 с, Н 3 усл. ед, соответственно хемкпюмивесценцЕя липопротеидов низкой плотноста из 0,2 МП сьшоротки крови: S 26,5ус ед.,Ь 4,5 усл. ед., t 35 с, Н 8 усл.ед. После искусственно вызванного гипотонического гемолиза оптическая плот ность сыворотхи крови увеличилась до 2,3 Параметры вспыиши инициированной двухвалентным железом хемилюминесценции 1 мл сыворотки крови изменились следующим образом: 5 5,5 (.61%), 1i 9,5 (63%) t 190с (1О9%), Н 1,5 усл.ед. (50%), соответственно хемилюминесценПИЯ липопротеидов низкой плотности из 0,2 МП сьюоротки крови: G 22 усл. ед. (83%), И 5,5 усл.ед. (122%), t4Oc (114%), Н 7усл.ед. (88%).. П р и м е р 3. Берут сьшоротку кро-, ви беспородного - кролика массой 3,4 кг, К 0,2 мл сыворотки крови кролика до- балвяют 2 мл О, раствора хлористого кальция и 0,2 мл 1%-ного раствора кристаллического гепарина. Полученный раствор инкубируют 4 мин и затем пентрифугируют 5 мин при 3000 об/мин. Супернатант удаляют, к осадку добавляют 1 мл 0,85%-ного раствора хлористого натрия и помещают в кювету хемилюминесцентной установки, куда добавляют 8 мл 120 мМ фосфатного буфера рН 7,4. К полученной суспензии липопротеидов низкой плотности добавляют 1 мл 25 мМ раствора двухвалентного железа (FeSQ4 7 ) возникает вспышка хеми|люминесценции. Оптическая плотность сыворотки крови при 440 нм составляет О,29. Параметры вспьпшси инициированной двухвадентным железом хемилюминесцении 0,2мл рывороткк крови равны: 9 45,5 усл.ед., fl в усл.ед., t 45 с, Н 9 усл.ед., соответственно хемилюмкнесценхши липопротеидов низкой плотности из 0,2 мл сьгаоротки крови: S24,5 уел, ед., И 3,5 усл.ед., -Ь 80 с,Н 6 усл. ед. После искус твенно вызванного гипотонического гемолиза оптическая плотность сьшоро ки крови увеличилась до 1,12. Параметры вспьшиси инициированной двухвалентным железом хемилюмкнесценпли О,2 мл сьгооротки крови изменились следующим образом: О усл. ед., 3 усл. ед. (50%), i; Ос, НО, соответственно . хемилюминесценция липопротеидов низкой плотности из 0,2 мл сыворотки крови: S 24 усл. ед. (98%), -Ь 3 усл. ед. (86%), t80c (100%), И 5 усл. ед. (83%). Таким образом, для регистрации хемиюминесценции плазмы и; сьюоротки крови Оптимальными условиями для человека являются 0,2 мл сыворотки крови, 2 мл О,28%-наго раствора хлористого кальция и 0,О4 мл 1%-ного раствора гепарина. ля сывороткик{юви кролика оптимальыми условиями экспериментально выбрао 0,2 мл сьшоротки крови, 2 мл 0,28%594ного раствора хлористого кальция, 0,2 мл 1%-ного раствора гепарина. Предлагаемый способ позволяет поеь1 сить точность регистрации хемилюминеспеншш сьшороткн крови и плазмы человека и экспериментальных животных при различной степени гемолиза и определить состояние перекисного окисления липидов в организме больного. Формула изобретения Способ определения хемилюминесценшш плазмы и сьторотки крови путем добавления двухвалентного железа и реги2страшш вспышки свечения, о т л и - чающийся тем, что, с целью повышения точности метода путем устреннкя влияния гемЬлиза, сыворотку шш плазму крови предварительно обрабатъ вают растворами хлористого кальция в кристаллического гепарина и выделяют липопротеиды низкой плотности. Источники информация, принятые во внимание при сспертвзе 1. Владимиров Ю. А. и др. Хемюпом несценция сьторотки крови в присутствии солей двухвалентного железа. Вопросы медицинской химии. 1976, № 2, с. 216 -