Способ получения -галактозидазы Советский патент 1975 года по МПК C12D13/10 

I

Изобретение относится к области биохимической промышленности, в частности к способам получения р-галактозидазы.

Известен способ получения |э-галактозндазы путем культнвиравання плесневых грибов на водной питательной среде.

С целью новышения активности р-галактозндазы но предлагаемому способу из плесневых грибов используют грИбы рода Curvularia.

Из рода Curvularia используют вид inaequalis, а из вида Curvularia inaequalis используют штамм 7.

Пример. В качестве продуцента р-галактозидазы используют плесневый гриб Curvularia inaequalis, который выращивают иа среде следующего состава, г/л:

Соевая мука10-50

Лимонная кислота5-30

(NH4)2S041-5

Na2HPO42-20

MgSO40,1-0,5

KCl0,1 - 1,0

при рИ2,0-6,0.

Эта среда обеспечивает высокий уровень биосинтеза р-гала-ктозидазы, на биосинтез особеино влияет начальная величина рН среды.

При культивировании на такой среде этого гриба выход фермента в 2-2,5 раза больше, чем при вьтращнвании Alternaria. 95- 98% р-ГалактоЗИдазы нереходит в культуральную жидкость, что наблюдается только на среде этого состава и значительно облегчает дальнейшее выделение препарата р-галактозидазы.

При доба.влении п данную среду 2-10% галактозы образование фермента увеличнвается на 20-30%. Сухой иорошок ферментного

препарата (З-галактозидазы получается при последующем осаждении культуральной жидкости органическими растворителями. Активность препарата, определяемая по о-иитрофенил-р-Д-галактопиранозиду, равна 800 ед/г,

удельная акти1виость - 3,0 ед/1 мг белка, а

при определении по лактозе 550,0 ед/1 г,

удельная активность равиа 2,0 ед/мг белка.

За единнцу активности р-гала.ктозидазы

приинмается такое коли1чество фермента, которое за 1 мин при 30°С и рП 4,2 гидролизует 1 мкмоль о-нитрофбнил-р-Д-галактопирапозида или лактозы.

Активность р-галактозидазы определяется колорнм1етрически по появлению -молекул

о-нитрофенола, освобождающегося под действием фермента из бесцветного о-аштрофенил-р-Д-галактопиранозида при рП 4,2.

При гидролизе лактозы глюкозооксидазным методом определяется глюкоза.

Оптимум рН для действия р-галактозидазы данного продуцента равен 4,2-4,6. При рН а,О или нри рМ 6,0 сохраняется 70% активности. Ферментный нрепарат обладает высокой сгабилыюстыо в отличие от дрожжевой (-)-галактозидазы. При выдерживаиии в растворах нри рН 2,0-8,0 в течение 24 час активность сохра1няется на 100%. (: -Галактозидаза иоиользуется для гидролиза лактозы молочных нродуктов до глюкозы и галактозы. При гидролизе слаборастворимый, несладкий, не сбраживающийся хлебонекариыми дрожжами, иногда ие усваивающийся животным организмом, дисахарид-лактоза нревращается в растворимую, более сладкую, сбраживаемую, усваивающуюся смесь моносахаридов. Па этом основано практическое ирименеиие р-галактозидазы в хлебопечении, медицине, ветеринарии, кондитерской нромышлеиности, животноводстве и в тех отраслях пищевой промышленности, которые связаиы с утилизацией побочных продуктов переработки молока и с консервированием молока. Пиже приводятся примеры культиеироваиия гриба Curvularia inaequalis-продуцеита р-галактозидазы. Посевным материалом служит суточная культура грибов, выращенная при 28°С на агаризоваииой среде следующего состава, г/л: Кукурузный экстракт, мл3-10 Лактоза10-50 ЫП4ЫОз1-10 Na2nP040,1-1,0 MgS040,1-1,0 KCl0,1-1,0 при рП5,0-8,0 Дальнейшее глубинное культивирование гриба проводят в течение 2-5 суток при 28°С иа средах следующего состава, г/л: Среда № 1 - оитималь-иая для биосинтеза р-галактозидазы. 10-50 Соевая мука 5-30 Лимонная кислота 1-5 (NH4)2S04 2-20 Ыа2ПР04 0,1-0,5 MgSO4 0,1 - 1,0 KCl 2,0-6,0. при рН Мицелий отделяют от культур альпои жидкости. В культуральпую жидкость переходит до 98% всего синтезированиого фермента. Препарат фермента получается осаждением органическими растворителями. Активность препарата (по о-нитрофенил-р-Д-галактопиранозиду) равпа 800 ед/г, удельная активность - 3,0 ед/мг белка. При определенин активности с лактозой в качестве субстрата - 550 ед па г, удельная активность 2,0 ед иа мг белка. Среда № 2. В среду № 1 добавляют 2- 10 г/л галактозы, при этом выход фермента увеличивается на 20-30% ио сравнению со средой № 1. Среда ЛЬ 3 - оиитети-ческая. Ла1ктоза15,00 (NH4)2SO42,00 КП2Р0413,60 MgS040,15 KCl0,50 |нри pli4,6. Выход р-галактозидазы 12 ед/1л культуральиой жидкости и 8 единиц остается в мицелии. Среда № 4. Кукурузный экстракт, мл10 Лактоза, г30 ЫП4ЫОз3 К2ПР041 MgS04 7П200,5 KCl0,5 нри рН4,1-4,3. Выход р-галактозидазы равен 92 ед/л среды и 36 единиц остается в мицелии. Физиолого-биохимичеокие признаки Curvularia inequalis относятся к порядку MoniHales семейству Dematiaceae. Гр.иб отнесен к виду Curvularia inaequalis. Синонимы: nelminthosporium inaequalis Shear. Bull. Torn. Club. 34, 307, 1907 Brachycladium ramosum Rainier. Bull. Trimestr. Soc. Micol. France 24, 80, 1908 Curvularia, ramosa Bacdijn - Bull Sardian Botan. Buitenzord. Ser. III. 13, 129, 1933. В культуре споры имеют раз-меры (24) - 28 - 40 - (60) (10) - 11 - 16 - (18) мкм, большей частью с четырьмя перегородками, изредка с тремя или пятью, споры изогнуты, концы спор округлые, копидиеносцы коричневые, септированные, нростые или иногда разветвленные, коленчатые на концах, различные по длине, 4-6 мкм в диаметре. Отношение длины споры к ширине постоянно и равно ,4; 2,3 и 2,5. Культурально-морфологическая характеристика па 10 сутки роста. Па синтетической среде Чанека с сахароой и NaNOs. Колонии диаметром 50-70 мм, с неровным краем, округлые, зональные от ЛИвково-серых по краю до темно-оливковых к центру. Воздушный мицелий серый, войлочный. братная сторона колоний корич1иево-.красая. Пигмента нет. Па сусло-агаре (сусло по Баллингу 5°). олоиии диаметром 50-100 мм с ровным раем, округлые, выпуклые с бугристой поерхностью. Воздушный мицелий обильный, бархатитый, сначала белый, затем серо-оливковый. братная сторона колонии бурая. Пигмента ет. Па среде с кукурузным экстрактом « лакозой колонки диаметром 70-80 мм с неровыми краями, серо-оливковые, к центру темо-оливковые, округлые, нлоские, зоиальость cлaiбo выражена. Воздущный мицелий

прижатый, шерстистый, серый. Обратная сторона колоиии бесцветная.

Физиолого-биохимические признаки.

Гриб синтезирует р-гала«тозидазу, инвертазу, нротеазу, (З-глюкозидазу, следы ос-амилазы. Отношение к источнику углерода: растет на лактозе, глюкозе, сахарозе, мальтозе, потребляет азот в аммоиийиой и нитратной форме.

Предмет изобретения

1. Снособ получения р-гала ктозидазы нутем культивирования плесневых грибов «а

водной нитательной среде, отличающийся тем, что, с целью повышения активности |5-гала«тозидазы, из плесневых грибов используют грибы рода Curvularia.

2. Снособ по и. 1, отличающийся тем, что из рода Сцгуц1аг1а используют вид inaequalis.

3. Способ по пп. 1 и 2, отличающийся тем, что из вида Curvularia inaequails используют штамм 7.