Способ получения алкалоидов спорыньи Советский патент 1984 года по МПК C12P1/06 A61K35/66 

со

О)

Изобретение относится к медицине в частности к способам получения алкалоидов спорыньи.

Известен способ получения алкалоидов спорыньи путем ферментации продуцента Claviceps purpurea в аэро ных условиях на питательной среде, содержащей источники углерода и азота, минеральные соли, с последующим выделением целевого продукта L1

Однако известный способ не обеспечивает получения повышенного содержания з-эргокриптина в алкалоидной смеси.

Целью изобретения является направленный биосинтез алкалоидов типа эргокорнина и повыше 1ше содержания (Ь -эргокриптина.

Поставленная цель достигается тем что согласно способу алкалоидов спорыньи путем ферментагщи продуцента Claviceps purpurea в аэробных условиях на питательной среде, содержащей источники углерода и азота, минеральные соли, с последующим вьц;елением целевого продукта, в качестве продуцента используют штамм Claviceps purpurea MNG 00186, а ферментацию ведут при 20-26С и рН 5,2-5,8,

Ферментацию ведут в присутствии 0,2 г/100 МП валина или 0,12 г/100 м валина и изолейцина при соотношении последных 5:1,

Для осуществления способа используют новый штамм Claviceps purpurea MNG 00186, который получен путем многократного повторения операции выделения и обогащения. Штамм хранится в национальной коллекции культур микроорганизмов MNG под номером 00186 и характеризуется следующими культурально-морфйлогическими и физиолого-биохимическими свойствами

Культурально-морфологические признаки.

На применяемой для отбора агаровой среде, содержащей крахмал и Фриптофан, череЪ 10 дней наблкщаются четко разграниченные колонии со складчатой поверхностью и оранжеворозовой окраской диаметром 6-8 мм. Через 20 дней диаметр колоний состав ляет 20-25 мм, колонии имеют в середине возвышение и радиальную складчатость, цвет - розово-лиловый. Нижняя сторона колоний темно-1соричневая питательная среда вокруг них окрашивается в лиловый цвет.

На солодовом агаре через 10 дней штамм образует светло-бежевые колонии диаметром 1-2 мм и правильной полусферической формы. Через 20 дней КОЛОНИИ имеют диаметр 2-4 мм, рост слабый, окраска изменяется до коричневой ,

На Sf-arape колонии штамма через 10 дней четко разграничены, в направлении к середине изборождены складками, в середине имеют остроконечное возвышение, диаметр колоний 8-12 мм. Вершина имеет высоту 3-5 , Окраска колоний бежевая до светлокоричневой. Через 20 дней поверхность колоний твердеет и по направлению к краям изборождена разве вляюШJ миcя складка1чи5 вершина становится кратерообразной. Колонии имеют CBSTло-коричневую окраску с оттенком какао, диаметр различный (25-40мм), высота 6-8 мм. Колонии с трудом отделяются от поверхности агарНэ не образуют спор.

Микроскопическая характеристика , Птамма в жидкой культуре. -

После 40 ч культивирования в питательной соеде GK имеются колонии из немногих клеток или большей частью отдельные клетки. Величина клеток 48 X 8-20/ч-J клетки и;-шиндрические5 округленные или неправртльной формы. Деление на конце клеток и путем бокового ветвления. Ряды клеток короткие, состоят из нескольких клеток. Под фазоБоконтрастным микроскопом клетки оказываются сильно гранулиро- ванными, более старые клетки содержат вакуоли. Спорообразования нет.

В St-питательной среде после 40 ч культивирования наблюдается идентичная картина, при этом на питательной среде имеется более частое образование колоний или рядов клеток.Отдельные клетки более крупные, более старые клетки не имеют вакуолей.

Физиолого-биохимические свойства.

Разрушает с помощью фермента /Э фруктофуранозидазы сахарозу с получением промежуточных олигосахаридов, орошо использует лимонную кислоту, образует пигмент антрахиннового характера, состоящий в первую очередь из оксиантрахинонов.

При культйвироаании на питательной среде, содержащей сахар и аммониевую соль органической кислоты, пггамм продуцирует алкалоиды, 25-30% образукнцейся смеси алкалоидов представляет собой fj -эргокриптин, осно ное количество (55-60%) - эргокорнин оставшаяся часть - -эргокриптин. Кроме характерных пептидных алкалоидов, штамм образует только эргометрин Пример 1 , Выращенную на St-агар-питательной среде культуру Claviceps purpurea MNG-00186 икокулируют на 100 МП питательной среды GK, находящейся в колбе Эрленмейера (ЗОО мл) и инкубируют при на встряхивающем аппарате (300 встряу:кваний в 1 мин) в течение 4 дней. Полученную культуру по 10 МП повторна инокулируют в восьми других колбах, содержаищх по 100 мл St-питательной среды/ Эти культуры ферментируют при 24°С на встряхивающем аппарате в те чение 7 дней. В 4 колбы не прибавляют исходное вещество, к содержимому других- 4 колб в начале ферментации прибавляют по,2 г валина в ка честве исходного вещества. На 7 ден ферментацию прекращают. Культуральные жидкости без исходного вещества объединяют определяют содержание алкалоидов в FCHX. Содержание эргокорнина cocTaejiifer 80 -у/мп,; о6-эрго криптина - и э-эргокриптина ЗО/мп. Приготовленные вместе с исходным веществом культуральные жидкости так же объединяют и опредеаяют содержани алкалоидов. Эти жидкости содержат. /мл sproKopm-iH 250,, ei-эргокриптин 25 и уэ-эргокриптин 30, Применяемые питательные среды. Питательная среда: Трипказин,. г7,; О Лимонная кислота, г4,0 Кислый форсфорнокислый калий (первичный), г Сульфат магния, г Гидроокись аммония ДорН 5,7-5 До 840 Вода, мл В колбы наливают по 84 или 840 м питательной среды и в-стерильньк ус виях смешивают соответственно с 16 160 МП 50%-ной лимонной кислоты. St-питательная среда: Сахароза, г100,0 Янтарная кислота,г10,0 Кислый фосфорнокислый калий (первичный) 5г0,25 Сульфат магния,г0,25 Нитрат аммония, г Хлористьй{ калий, г Гидооокись аммония ДорН 5, 2-5,3 Вода, Mil, До 1000 Питательную среду стерилизуют пор-циями по 100 мл в колбах Эрленмейера или в количестве 100 л в полупроизврД ственном ферменторе. St-агар-питательная среда (Blake) отличается от жидкой питательной среды St TeMj. что к ней прибавляют 25-г/л порошка агара. После добавки агара питательную среду кипятят, порциями по 150 мл наливают в бутылочки и стерилизуют. Пример 2. Типичные выращенные на St-агар-питательной среде двадцатидневного возраста колонии Claviceps purpurea ШС 00186 отделяют от поверхности агара, гомогенизируют в 20 мл стерильного физиологичес кого раствора поваренной соли и 10 мп суспензии прибавляют к 100 мл предварительно простерилизованной находящейся в колбе Эрленмейера (500 мл) St-питательной среды. Культуру культивируют в течение 6 дней при 24 С на встряхивающем аппарате и затем повторно инокулируют на 100 мл находящейся в колбе Эрленмейера (500 мл) питательной среды ТС-54, После 3 дней ферментатдаи на встряхивающем аппарате 10 МП культуры повторно инокулируют на 100 МП находящейся в колбе Эрлеимейера (500 мл) простерилизованной St-питательной среды. Эту культуру .при укзанньгх условиях культивируют на встряхивающем аппарате в течение 7 днейь После этого она содержит следующие количества алкалои-дов, у/мл: эргокор шн 150, oi,-3proкриптин 40,и /i-эргокриптин 90. Пример 3. Двадцатипятидневную культуру Claviceps purpurea MNG 00186 на St-агар-питательной среде удаляют, соскреЬая, с поверхности агара и гомогенизируют в 100 мл физиологического раствора поваренной соли. Полученной суспензией инокулируют. I л питательной среды GK предварительно простерилизованной в колбе Эрленмейера объемом 3 л. Культуру встряхивают при в течение 44 Затем культуру помещают в. ферментор объемом 15 л, в котором находится 10 л питательной среды ТС-54. Ферментируют при 24°С подаче 0,25 л/л мин воздуха и 240 об/мин. Через 3 дня культуру переносят в кислотостойкий лабораторньш ферментор (150 л), а

5 11196096

котор ом находится 100 л.81:-питательнойЮО г вааина и 20 г изолейцисреды. Эту культуру культивируют„a.

при 22°С 150 об/мин и 0,35 л/л минПосле ферментации в течение шести

подводимого воздуха в -(еченке 6 дней.дней культуральная жидкость содержит

На / -, 3- и 5-й день к культу-5 -у/мп: эргокорнин 320, оС-эргокриптин

рапьной жидкости прибавляют по60 и /3-эргокриптин 160,

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АЛКАЛОВДОВ СПОРЫНЬИ путем ферментации продуцента Claviceps purpurea в аэробных условиях на питательной среде. содержащей источники углерода и азота, генеральные соли, с последующим выделением целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью направленного биосинтеза алкалоидов типа эргокорнина и повышения содержания /3-эргокриптина, в качестве продуцента используют штамм Claviceps purpurea MNG 00186, а ферментацию ведут при 20-26°С и рН 5,25,8. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что, с целью дополгнительного повьшения выхода целе вых. продуктов, ферментацию ведут в присутствии 0,2 г/100 мл валика I или 0,12 г/100 мл валИна и изолейО) цина при соотношении последних 5:1.