Способ получения пептидов или их солей Советский патент 1982 года по МПК C07K5/113 C07K5/107 A61K38/07 

Изобретение относится к способу получения пептидов - новых биологически активных соединений, которые могут найти применение в биохимии и медицине. В химии пептидов широко использу ют метод постепенного наращивания пептидной цепи за счет конденсации активированных аминокислот, например, способам активированных эфиров Цель изобретения - синтез новых пептидов, содержащих хрбмогенную группу, которые обладают интересным свойствами. Поставленная цель достигается те что;согласно способу получения пепт дов общей формулы А/2.- Гли - Apr - NHR2, где R - водород, бензоил; п-нитроанилид; аспарагинил, глицил, изрлейцил, лейцил, валил, про лил, тирозил, фенилаланил; глютаминовая кислота, глютамин, аспарагиновая кисло или их солей, соединение Общей формулы IIjN-Rj, в которой R имеет указа ные значения подвергают взаимодействию с соответствующей аминокислотой и далее требуемую пептидную структуру постепенно наращивают путем сочетания остальных аминокислот, причем группу RJ используют в качестве защитной группы для С-концевой карбоксильной группы первой агли но кислоты. Для наращивания требуемой пептидной структуры используют сочетания аминокислот методом активированных эфиров. В этом ступенчатом синтезе пептидных производных используют хорошо известные в химии пептидов способы и защитные группы: карбобензокси (Кбо), пара-метоксикарбобензокси.(МеОКб), пара-нитрокарбобензокси (NOj Кбо), пара-метоксифенилазо-карбобензокси (Мкбо), трет-бутилоксикарбонил (БОК), трифторацетил (ТФА) или формил применяют в качестве аминозащитных групп; «.-карбоксильную группу активируют путем конверсии в различные производные , которые или могут быть выделены или.получены In situ, например, пара-нитрофениловый сложный эфир, трихлорфениловый, пентахлорфениловый, N-гидроксисукцинимидовый, азид и ангидрид кислоты, которые могут быть симметричными.или несимметричными. Могут быть активированы также N-кар бодиимидом, например, N, М-дицикло гексилкарбодиимидом. Концевая кар6о ксильная группа в аминопептидном пр изводном или производном аминокисло ты может быть защищена путем этериф кадии в метиловый,этиловый или изо рропиловый эфир или путем превращения в хромофорное анилиновое производное, которое также выполняет фун кцию защитной группы во время наращ вания пептидной цепи. Те свободные функциональные группы, которые не принимают участия в реакции во врем синтеза пептидов или их производных могут быть защищены следующимОбразом. Для защиты остающейся аргинил-гуанидинр-группы используют протонизацию, NO/j или пара-толуолсульфонил ТОС). В качестве защиты карбоксильной группы в глютаминовой кислоте и аспарагиновой кислоте применяют бензильную и трет-бутильную группы. Для анализа элюатов и продуктов используют хроматографию в тонком слое силикагеля р254(®рк) Используют следующие системы рас ворителей ; Л при объемном соотношении н-бутанол:уксусная кислота: вод равном. 3:1:1; С при объемном соотно цГении, н-пропанол: этилацетат: вода, равном 7:1:2; Д при объемном соотно шении п-гептан:н-бутанол:уксусная кислота, равном 3:2:1; Р при объемном соотношении хлороформ:метанол, равном 9:1. После хроматографирования в тонком слое пластинки просматривают в УФ-свете (254 Им) и затем ют хлор/толуидиновым. рёагентомТ Далее применены следующиеcdkpaщения., Аминокислоты. Свободные аминокислоты или пепти указываются с помощью буквы Н у ами ногруппы и ОН у карбоксильной групп Аминогруппа всегда указывается, слев карбоксильная группа справа. Все применяюгциеся аминокислоты имеют L-конфигурацию, если не огово рено дополнительно. Ала-аланин; . . Гли-глицин; Арг-аргинин; Илей-изолейцин; Асп-аспарагин; Лей-лейцин; Лспа-аспарагиновая Мет-метионин; кислота; Глю-глютамин ;.Фе-фенилаланин; Глю-гл12таминовая Про-пролин; кислота;. Тир-тирозин;Bart-Валин, Другие сокращения: Ац-ацетил;МкбО-метоксифени азокарбобензокси Ац5 0-уксусныйМеОН-метанол; ангидрид; . ЛцОН-уксусная ОтБ-трет.бутилокси; кислота; Бок-трет.бутилОЭТ-Этилоксиоксикарбонил; БзОЛ-бензоил; Оме-метилокси; Бзл-бензил;. ОпНФ-пара-нитрофеНокси;Б32 О-бензойный ОизоП-изопропилангидрид; .окси; КбО-карбобенз- пНА-пара-нитроани окси;лид; Дцгкдй-дициклогек- ТФА-трифторацетил; силкарбодиимид;. . ЭТдN-триэтиламин; ТОС-пара-толуолсульфонил. В примерах, если специально не оговаривается, температура . Пример : НС1 Бзл-Илей-Глю-Гдй-Арг-пИА. 1а.Кбо-Гли-Арг (N02)-nHA (Мол. вес.530,4). Раствор 5,0 г (10,6. ммоль) Кбо-Арг (N0) .-пНА в 21 мл АсОН и 22 мл 4 н. НВг в АсОН в безводных условиях переме1ш-1вают 1 ч при комнатной температуре, затем медленно вливают в 200 мл эфира при энергичном перемешивании. Эфирный раствор отделяют декантацией, а полученный зернистый остаток обрабатывают два раза эфиром по 100 мл. После суижи в вакууме над и таблетками КОН при получают бромистоводородную соль аминокислотного производного почти количественно (4,95 г). Продукт гомогенный согласно тонкослойной хроматографии (тех) в системе А. Продукт растворяют в- 50 мл перегнанного диметилформамида, раствор охлаждают до -10°С и добавляют триэтаноламин до нейтрального значения рН (2,1 мл). Выпавший в осадок бромгидрат триэтаноламина отфильтровывают и фильтрат охлаждают до . К раствору добавляют 3,9 г (11,8 ммоль) Кбо-Гли-ОпНФ, смесь медленно нагревают до комнатной температуры. 3 ч раствор вновь охлаждают до и вносят 0,54 г (5, 3 ммоль) триэтаноламина. Через 2-3 ч добавляют вновь такое же количество триэтаноламина. Реакционную смесь оставляют на ночь при комнатной температуре, затем упаривают в вакууме при 40 С. Оставшееся тяжелое масло тщательно перемешивают с 100 мл дисйгиллированной воды. Воду сливают и промывку повторяют еще два раза. Оставшееся масло растворяют в горячемКОН, по охлаждении продукт осаждается в кристаллической форме. Выход 4,2 г, продукт гомогенный согласно ТСХ в системе Р , Щ 0,16,tct -36° (с 0,50 метанол). Ib: Нок-Глю-( и -рбзл)-Гли-Арг(КО2)-пНА (мол. вес 715,8). 2,65 г (5,0 ммоль) продукта 1а декарбобензоксилируют и конденсируют с 2,5 г (5,5 ммоль) Бок-Глю(-Обзл ОпНФ согласно примеру 1а. Продукт чистят в хроматографической колонке с Сефадексом ZH в метаноле. Выход 3,25 г (91%). Продукт гомогенный согласно тех в системе Pf (R/ 0,22), 5 -34° (с 1,0,метанол).

1с: Кбо-Илен-Глю (у -Oбзл)-Гли-Apг(N02) -пПА, (Мол.вес 862,9).

1,08 г (1,5 ммоль) продукта Ib Ьастворяют в ДО 4л трифторацетата. Ю Раствор перемешивают 1 ч при комнатной температуре, затем медленно вливают в 75 мл эфира.при сильном перемекгавании. Эфирный раствор декантируют и получен1|ь1й зернистьзй остаток два раза обрабатЕлвают эфиром по 50 мл. После сушки ввакууме над и таблетками КОН при 30с получена трифторуксуснркислая; соль трипептидного произввдного почт.и количественно (l,OOr)2Q Продукт гомогенный согласно ТСХ в;системе Л. .

Продукт растворяют в 20 мл диметилформамида. Раствор охлаждают до ,-10°С и нейтрализуют триэтаноламином 25 (0,23 4л) , добавляют 0,65 г (1,68 ммоль) Кбо-Илей-ОпНФ и медленно поднимают температуру раствора до комнатной. Через 3 ч раствор вновь охлаждают до -10°С и добавляют 0,12 мл . триэтаноламина. Через 2-3 ч повторно добавляют триэтаноламин и раствор оставляют на ночь. Затем избыток Кбо-Илей-ОпНФ разрушают добавлением 100 мг (1,4 ммоль) н-бутиламина к раствору.- Через 30 мин раствор упа- 35 ривают в вакууме при 40°С. Оставшееся тяжелое масло промывают тремя порциями дистиллированной воды. Касло растворяют в МеОН и чистят хроматографией на Сефадексё ZH-20 в метано- 40 ле. Выход 1,07 г (83%). Продукт гомогенный согласно ТСХ в системе Р,, R 0,35гС« 1:э -24 (сО,ЗМеОН: диметилформамид 95:5).

Id: Бзл-Илей-Глю ( J -Обзл)-Гли- 45 -Apr (N02)-nHA.

260 мг (0,30 ммоль) продукта 1с дикарбобензоксилируют согласно примеру 1а. Продукт показывает два пятна на тех в системе Л, (R 0,45 CQ и 0,65), и с помощью инфракрасной спектроскопии обнаружено, что продукт является смесью ПВг; И-Илёй-Глю( ;f-ОН) -Гли-Арг(Ы02)-пИА и НВг-Н-Илей-Глю . ( у -Обзл) -Глй-Арг (N0.) -пНА.Эта смесь и 800 мг (0,35 ммоль) бензойного ангидрида взаимодействуют в условиях, описанных в примере 1а. Продукт чистят на Сефадексё ZH-20 в метаноле. Получают две фракции: pi - 130 мг, «3|f -15(с 0,50 CH,CN)pO Ri 0,20 в Р и f - 105 Mrtoilo -11° (с 0,5, СНзСМ)И 0,06 в Р .

С помовд ю инфракрасной спектроскопии обнаружено, что этими двумя фракциями являются Бэл-Илей-Глю( И -Обзл) - 65

-Гли-Арг(N0;)-пИА и Бэл-Илей-Глю-Гли-Арг (N0 2 ) .-..

При взаимодействии с фтористым водородом обе фракции дают оди-наковый конечный продукт 1е.

1е :ИС1 Бзл-ИлеП-Глю-Гли-Apr-nflA (мол. вес 734).

100 мг (0,12 ммоль) «; -продукта Id и 0,5 мл анизола помещают в реакционную колбу аппарата Сакакибара. В колбу отгоняют 5 мл сухого фтористого водорода и оставляют реакционную массу на 75 мин при ос. Затем фтористый водород отгоняют под уменьшенным давлением, маслянистый остаток растворяют в 10 мл уксусной кислоты и чистят хроматографией на Сефадексё g-15 в 33%-ной уксусной кислот (в воде) . Затем ф15акцию, содержащую чистое незащищенное тетрапептидное производное, лиофилизуют. Полученное соединение растворяют в смеси метаНОЛ:дистиллированная вода (95:5) и хроматографируют на слабоосновном анонном обменнике Q АЕ-СефаДекс А-25 в хлоридной форме, для элюирования используют ту же смесь растворителей Метанол удаляют из элюата при под уменьшенным давлением и оставшийся водный раствор лиофилизируют. Выход 75 мг (85%), продукт однороден согласно ТСХ в системе А (Rf 0,48 о -40° (с 0,5, уксусная кислота в дистиллированной воде).

Анализ на аминокислоты: 0,98 Илей 0,5 Глю, 0,98 Apr, 1,00 Гли.

П р и м е р II: 2НС1 Н-Ипей-Глю-Гли-Арг-пИА.

На: 2НС1 Н-Илей-Глю-Гли-Арг-пНА (мол.вес 666,6).

100 мг (0,116 ммоль) продукта 1с обрабатывают с фтористым водородом и чистят в условиях, описанных в примере 1а.

- Выход 56 мг (73%), продукт однороден согласно тех в системе А, jl 0,34, -35° (с 0,5, 50%-ная уксусная кислота в дистиллированной воде).

Анализ на аминокислоты: 0,96 Илей 0,94 Глю, 0,96 Apr, 1,00 Гли.

Пример III: НС 1 Бзл-Млей-ГлнГли-Арг-пНА (мол.вес. 733,2).

Ilia: Кбо-Глн-Гли-Арг (N02)-nHA (мол. вес 658,5).

2,65 г (5 ммоль) соединения Кбо-Гли-Арг(NOj) пНА декарбобензоксилируют бромистым водородом в уксусной кислоте и копулируют с 2,2 г, (5,5 ммоль) Кбо-Глн-ОпНФ по методу, описанному в примере 1а. Неочищенный продукт очищают двойной перекристаллизацией из метанола.

Выход 2,07 г ,(63%) Ilia. Гомогенность в соответствии с ТСХ в системе A(RI 0,62), -23 (с 0,5 метанол/диметилформамид 9/1).

IIIb: Трет-Бок-Илей-Глн-Гли-Арг (N02)-nHA (мол. вес 737,6).

0,66 г (1 ммоль) соединения Ilia декарбобензоксилируют бромистым водородом в АсОН по методу, описанному в примере 1а. Полученное соединение растворяют в 10 мл перегнанного диметилформамида.1 Раствор охлаждают до и доВавляют триэтиламин до нейтральной реакции. Выпавший в осадок бромгидрат триэтиламина отфил тровывают, фильтрат вновь охлаждают до и к нему добавляют 0,40 г (1,1 1 из5оль) Бок-Илей-ОпНФ и раствор оставляют медленно нагребаться до комнатной температуры. Черей 3 ч рас вор вновь охлаждают до -10°С и буферируют 0,1 глл. (0,7 ммоль) триэтанолг амина, Буферирование повторяют через 2-3 ч. Реакционный раствор оставляют до утра и избыток трет-Бок-ИЛей-ОпНФ приводят во взаимодействие с 0,1 мл (1 ммоль) н-бутиламина. Через 30 мин раствор упаривают в вакууме при 40°G Оставшееся тяжёлое масло тщательно перемешивают с 100 мл дистиллирован ной воды. Воду декантируют и промывку проводят еще дважды. Оставшееся масло растворяют в метаноле и очищают в колонке .с сефадексрм ZH-20 в метаноле, используя в качестве элюирующего средства метанол. Выход 0,56 г (76%). Гомогенность по ТСХ в системе А (Rf 0,66.).

II1с. Бэл-Глн-Гли- Arg(N02)4iHA мол. вес 741,6) .

0,56 (0,76 ммоль) продукта Illb растворяют в 5 мл трифторуксусной кислоты. Раствор перемешивают 15 мин при комнатной температуре, после чего медленно выливают в 100 мл энергично перемешиваемого сухого эфира. Эфир отделяют декантацией и осадок дважды обрабатывают 50 мл эфира. После сушки в вакууме над и таблетками КОН при 30°С получают трифторуксусную соль тетрапептидного производного почти количественно. Продукт гомогенен в соответствии с тонкослойной хроматограммой в системе А.

Полученное соединение растворяют в 8 мл диметилформамида, охлаждают до -10 С и нейтрализуют триэтаноламином. Вносят 0,23 г (1 ммоль) бензойного ангидрида и через 30 мин добавляют еще 1,00 мкл триэтаноламина. Реакционный раствор оставляют до утра и упаривают в вакууме при . Оставшееся тяжелое масло тщательно перемешивают с дистиллированной водой Воду декантируют, оставшееся масло растворяют в метаноле и очищают в колонке, содержащей сефадекс ZH-20 в Метайоле. Выход 0,55 г (95%). Гомогенность по тех в системе А (Rf 0,64).

Hid. Бзл-Илей-Гли-Глн-Арг-пНА-НС1 (мол. вес 733,3).

0,55 г (0,75 ммоль)III приводят во взаимодействие с фтористоводородной кислотой, очищают (ионообменно) по методу, описанному в примере 1е. Выход 0,34 г (62%), Гомогенность по ТСХ в системе А (Rf 0,41), -40 (с 0,5, 50%-ная уксусная кислота в дистиллированной воде).

Остальные, промежуточные и конечные продукты, использованные в качестве примеров, синтезированы в соответствии с .методами, описанными в примерах I-III.

Получение этих соединений и их свойства приведены в таблице. 139 Формула изобретения . 1. Способ получения пептидов общей формулы К -А -А2-Гли - Apr - NHR2, где R - водород/ бензоил; RJ - Н -нитроанилид; А| - аспарагинил, глицил, изолейцил, лейцил, валил, пролил, тирозил, фенилаланил; AJ - глютаминовая кислота, глютамин, аспарагиновая кислота, или их солей, отличающийс я тем, что соединение общей формулы , в которой Rj имеет указанные значения, подвергают вза214имодействию с соответствукадей амино кислотой и далее требуемую пептидную структуру постепенно наращивают путем сочетания остальных аминокислот, причем группу R используют в качестве защитной группы для С - конценой карбоксильной группы первой аминокислоты. 2. Способ по п.1, о т л и ч а ющ и и с я тем, что для наращивания требуемой пептидной с±руктуры используют сочетания аминокислот методом активированных эфиров. ; Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1. Шредер Э. , Любке К. Пептиды, Ч. 1, М., Itop, 1967, с, 116.