Способ определения активности протеаз серина Советский патент 1980 года по МПК G01N33/16 

I. .

Изобретение относится к биохимии

Известен способ определения активности протеаз серина путём воздействия ферментосодержаадего материала на энзимный субстрат I.

Однако известный способ не обеспечивает высокой точности определе- ния активности протеаз серина.

Целью изобретения является повы-, шение точности способа..

Это достигается тем, что в качестве субстрата используют вещество общей формулы

илв-А-гки-арг-нн-Й,,

где R

ацил, преимущественно ацетил или бензоил; иле - изолейцин;;

А аспарагиновая или г.Л1отаминовая кислота, заме11 енная в карбоксильной группе образованием сложного эфира с коротким алкилом, оксиалкилом, замещенным аминоалкилом или цикло шкилом, или гuvIИдиpoвaнием моно- или дизамещениым коротким алкилом, оксиалкилом, замещенным амииоалкилом или гетероциклической группой,у которой азот амидной группы обра зуёт участок пиперидинового морфолинового или пиперазинового кольца; глицин;

гли. аргинин; арг нитрофенил.

Субстраты получают |из хромоген10ных или флюорогенных субстратов содержащих аминокислоты в последовательности соответственно ил-г.лю-гли-арг-и-ил-асп-гли-арг посредством образования сложно Ъвфирной группы или амидировагая свободной-j-ил и , р-карбоксильной группы известным способом.

При тонкослойном хроматографическсм анализе экстракта из адсорбента

9Л и продуктов в качестве абсорбционной среды берут стеклянные пластинки с силикагелем F-254. Используют систему раствеч ителей: хлороформ - метаноя-уксусиая кислота - вода в

соотношении 34:4s9:2. После тонкослойной хроматографии пластинки исследуют сначала в ультрафиолетовых лучах (254 нм), а затем с помощью хпортолуидиновбй реакции. Все использованные аминокислоты при отсутствии

других указаний имеют L -конфигурацию ,

Приняты следуюгцие сокращения: Apr - аргинин,асп - аспарагиновая .кислота, -тлю - глютаминовая кислота гли - глицин, иле -. иэолейцин, лей лейцин; Ас .- ацетил, АсОН - уксусная кислота, В - бенэоил, DCCe - . дициклогексилкарбодииьдад, ВМФ - диметилформамид, EtjN - триэтиламин, НОВТ - оксибензотриазол, HOSu N-оксиимид янтарной кислоты, МеОН метаноп, OEt - этилокси, ОМе. -метилокси, Ор NP -. п-нитрофенокси, OiSopизопропилокси, рмд - п-нитроанилид GAE - четвертичная аминоэтилсефароза, SOCCg хлористый тионил.

Пример Г. Субстрат Бензоил-ил-глю-арг-п-нитроанилид (5-2222 В2-ил-глю-(ОМе)-гли-арг-pNA ЯСС (мол.в, 748,2).

В безводных условиях при О°С 30 мл дистиллированного .бавляют к О,5 мл абсолютного метанола. После первоначальной реакции раствор оставляют стоять примерно на 15 мин при комнатной температуре затем добавляют 75 мг Вх - -ил-глю -гли-арг-pN А-нее () Раствор перемешивают в течение 5 ч, затем упаривают. Полученный маслообразный продукт растворяют в небольшом ко-личестве метанола и очищают по способу хроматографирования на геле на колонке, содержащей Сефадекс ZH20 в среде метанола. Для отмывки с адсорбента также применяют мета-. НОЛ. Чистый сложный метиловый эфир, полученный после выпаривания метанола, растворяют в воде и высушивают в замороженном состоянии. Выход 30 мг (40%). Продукт однороден по. . данным, тонкослойной хроматографии, R 0,33/ci/nминус40,3° (с 0,5, 50% НАОс /HjO).

Пример 2. Bz-ил-глю(O.tt)-гли-арг- МАнее (мол.в. 762,2).

В безводных условиях при температуре минус 60 мл дистиллированного до15авляют к 1,0 мл абсолютного этанола. Через 30 мин при комнатной температуре добавляют 150 мг субстрата S-2222. Примерно через 15 ч по окончании реакции (по данным тонкослойной хроматографии) раствор выпаривают. Полученное масло растворяют в небольшом количестве 30%-ной НОАс в воде и очищают посредством хроматографирования на колонке, содержащей Сефадекс -С 15 в среде 10%-Hejfb водного раствора. НОАс. ЧИсть1й сложный этилог вый. эфир, извлеченный из адсорбента высушивают в замороженном состоянии. Выход 70 мг (46%). Продукт однороден по. данным, тонкослойной хроматографии, R rO,40/c(./j3° минус 37,7° (с 0,5,50% НОАс/НгО),

Пример 3. Вг-ил-глю(015ОР2)-гли-арг-р (мол.в. 776,3).

. Осуществляют синтез по примеру 2, однако вместо эталона берут абсолютный изопропанол. Реакция заканчивается через 16 ч. Хроматографирование и высушивание в замороженном состоянии проводят по методике приведенной в примере 2, Выход 90 мг (58%). Продукт однороден по.

Q данным тонкослойной хроматографии,

,44 /ОС/, минус 36,4 (с 0,5, 50% НОАс/Н О).

Пример 4. BZ-ил-глю-(0-циклoгeкcил)-гли-арг-р VJ АНее (мол.в. 833,3).

560 мл SOjCCj добавляют к 1,0 мл

сухого циклогексанола и через 1 ч при комнатной температуре добавляют 200. мг 5-2222. По окончании реак- ции, примерно через 12 ч, раствор

0 упаривают и хроматографируют как

указано в примерах 2 и 3, Затем продукт высу1ливают в замороженном состоянии. Выход 170 мг (75%). Продукт однороден по данным тонкосл ояной

5 хроматографии, TJg - О , 50 /i-/р минус 38,6° (с 0,5, 50% НОАс/Н,,О) . ; Пример 5, В7-ил-глю-(0-СН СН. N(CH, )2-гли-арг-р N Л- HOf (мол.в, 859,8) .

Q75 г (0,10 ммоля) субстрата

S-2222 и 100 мг диметил-аминоэтанола-гидрохлорида растворяют в 1,О мл сухого дистиллированного, ДМФ, затем добавляют 10 МП пиридина, 10 мг ,

- НОВТ и в заключение добавляют 25 мг DCCE. Образовавшийся дициклогексилкарбамид отфильтровывают примерно через 24 ч и диметилформамидный раствор упаривают при пониженном давлении. Оставшееся масло растворя ют в небольшом количестве 95% МеОН5% Н.О и очищают на колонке, содерОАЕ-25

жащей ионообменник

в его

хлоридной форме. Ту же самую смесь растворителей используют для отмывки с адсорбента. Согласно этой методике получают хлористоводородную соль сложного диметиламиноэтилового эфира, свободную от примеси других пептидов, однако продукт содер ит незначительное количество некоторых загрязняющих примесей, например хлористоводородной соли диметиламиноэтанола. Фракцию, содержащую.сложный- диметиламиноэтиловый эфир,

упарива-ют и очищают хроматографированием на колонке, содержащей. Сефадекс 15 в 10% HOAc/Hj O. Раствор чистого сложного эфира высуимвают в замороженном виде, йлход 60 мг (58%). Продукт однороден по данным

тонкослойной хроматографии, Rr 0.,50/oL ( 1° минус 35,0 (с 0,5, 50% HOAc/HjO).

CONH-CH(CH,)2

П.ри м е р 6. Вг-ил-пЛю-гли-арг-рНА (мол.в. 775,3).

240 мг субстрата3-2222 HOSu растворяют в 1 мл сухого дистиллированного ОМФ, Раствор охлаждают до минус 5С и добавляют 120 мг tx:CE . Температуре дают подняться до комнатной и спустя 4 ч раствор внов . охлаждают до , выделившийся в виде осадка дициклогексилкарбамид отфильтровывают и промывают. ВМФ-раствор (около 2 мл) охлаждают до 0°С и добавляют 0,1 МП чистого изопропила мина.Через 70 ч выдерживания при, комнатной температуре раствор выпаривают при пониженном давлении, смешивают с 5 мл воды и вновь выпаривают. Продукт растворяют примерно в 4 мл 50% НОАС/Н20 и очищают хроматографированием на колонке, содержащей Сефадекс С-15 в среде 33% НОАс/Н,. Эту же смесь растворителей используют для отмывки с адсорбента. Фракцию, содержащую чистый изопропиламид, упаривают и подвергают ионному обмену в колонке, содержащей четвертичную аминоэтилсефарозу АЕ 25 в ее хлоридной (1орме, растворенной в 95% МеОН-5% НоО. . Экстракт из адсорбента выпаривают, растворяют в воде и высушивают в замороженном состоянии. Выход 120 мг (47%). Продукт однороден по данным тонкослойной хроматографии, 1 30,3 IdLl минус 30,6° (с 0,5, МеОН).

П-р-и м е р 7. Вг-ил-глю-гли-,

CONH) -apr-pNA (мол.в. 802,3)

Синтез Осуществляют по примеру б, однако используют пиперидин взамен изопропиламина. Выход 105 мг (40%). Продукт однороден по данным тонкослойной хроматографии, R.j 0,50 /Ы /2 минус 34° -(с 0,5, МеОН). Пример 8. В1.-ИЛ-ГЛЮ-ГЛИ-:

.c6NlCH,;CHj-OM) -apr-pNA (мол.в. 822,3)

Синтез проводят по примеру б, но применяют диэтаноламин вместо изопрпиламина. Выход 120 J45%) . Продукт однороден по данным тонкослойной хроматографии, TJf-О , 25 / oL ( минус 31° (с 0,5 МеОН).

Пример Э-Вг-ил-асп(oiSoPv-) -гли-арг-р И A-HCt I ло ъ. 762,3).

30 мл дистиллированного БОС добавляют к О,5 МП сухого изопропанола и после 30 мин стояния при комнатной температуре добавляют 73 мг (0,10 ммоля) Bz-ил-асп-гли-арг-pN А-НСЕ (мол. в. 720,2). По окон-, чании реакции, примерно через 18 ч, раствор упаривают, хроматографируют и высушивают .в замороженном состоянии, как указано в примерах 2, 3 и 4

йлход 32 мг (42%). Продукт одноро- ден по. . тонкослойной хроматографии ,46/о(/|,минус 22,7 (с - 0,5, 50% HOAc/H-jO) .

Л р и м е р 10. Ёг-ил-асп5 (OEt).-rJiH-apr-p Я А-НСе (мол .1в.74 8,2)1 Синтез проводят по примеру 9, но вместо иэопропанола применяют этапон. Выход 28 мг (37%). Продукт однороден по данным тонкослойк й Q хроматографии , 40/ot/f минус 23, (с 0,5, 50% HOAc/H O) . Пример 11. Вг-ил-асп-гли coNH-cHtoiOj

-арг-р NAHCC (мол. в. 761,3). ,. Синтез проводят, по примеру 6 нОприменяют Вг.-иЛ-асп-гли-арг-р NA-HCt в качестве исходного материала вместо 5-2222, Выход 100 мг (40%). Продукт однороден по данным, тонкослойной хроматографии, R - 0,40 /Oil

0 минус 20,1 (с - 0,5, МеОН).

Пример 12. В2.-ил-асп-гли0

CON

-apr-pNA (мол-, в. 818,3).

Синтез проводят по примеру 11, . но применяют морфолин взамен изопропиламина. Выход 95 мг (35%). Продукт однороден по. данным тонкослойной хроматографии, R - 0,46/с1/ минус 24,2° (с - 0,5 МеОН).

Определения К и ( Ктп константа Михаэлиса цдакс максимгшь-, ная скорость), получают, применяя уравнение Лайнвевера-Бурка:

, о waw;So

Затем с -«ешивают с субстратом в .буферном растворе и определяют спектрофотометрически скорость гидролиза. Концентрацию субстрата (Зо) измеряют, а концентрацию энзима сохраняют постоянной. Затем значения величин, обратныз скорости - , откладывают на графике относительно значений обратной концентрации - , По полученному графику Лайнвевера - Бурка определяют 3 (см, таблицу) ,

Субстракт растворяют в воде до 2 ммолей/л, буфер,энзим и субстрат, бмешивают и отсчитывают изменение абсорбируемости (О1Умин) при

405 нм при. 37° С,

Предлагаемый способ с помощью хромогенных субстратов обеспечивает высокую чувствительность и точность определения в течение короткого

времени, что позволяет проводить анализ большого количества образцов.

736889

Формула изобретения

Способ определения акти|знрстй npotea3 cepHiHa путё:м воздействия ферментосодерясащего материала на энзимный субстрат, отличающ и и с я тем, что, с. целью повышения точности способа , в качестве субстрата используют вещество общей формулы

R -ИЛ6 - Л-ГАн-арг -NH -Я 2

Р| ацил. Преимущественно

де ацетил или бензоил; изолейцин;

иле А

аспарагиновая и. глютаминовая кислота, замещенная в карбоксильной группе, образованием с л эжного эфира с коротким алкилом, оксиалкилом, замешенным аминоалкилом или циклоалкилом, или амиди)рованием моно- или диза мешенныМ коротким алкилом, оксиалкилом, зг1мещенным аминоалкилом или гетероциклической группой у которой азот аьмидной ГРУППЫ образует участок пиперидинового морфолинового или пипераэинового кольца гли - глицин; арг - аргинин; v - нитрофенил

Источники информации, ринятые во внимание при экспертизе

1. Тейен А,П., Лии М., АЙильд&ард У.. Исследования в области ромбоза. 1976, 8, 413.