Способ получения пептидов Советский патент 1988 года по МПК C07K14/61 A61K38/25 A61K38/07 

11

Изобретение относится к способу получения пептидов .- новых биологически активных соединений, которые могут найти применение в медицине.

Цель изобретения - способ получения новых синтетических укороченных пептидов, малотоксичных соединений, обладающих способностью стимулироват выделение гормона роста.

Пример 1. Синтез пептида (D-Ала) - человеческий панкреатический гормональный выделительный фактор (1-39)-NH2, имеющего формулу

H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn -Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-DAla-Gln-Se -Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile -Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn -Gln-Glu-Arg-Gly-NH

осуществляют ступенчатым образом, ис пользуя пептидный синтезатор Бек- ман 990, на параметилбензгидриламин- гидрохлоридной смоле, такой, какую поставляет фирма Bachem. Inc., имеюще пределы замещения примерно 0,1- 0,5 млмоль/г смолы. Связывание трет- -бутилоксикарбонил-Gly с 2 г смолы осуществляют общим способом, в схемах А и В, которые используют во всем синтезе, и это дает замещение примерно 0,35 млмоль СЛу на грамм смолы. Все используемые растворители тщательно обезгаживают путем продувки инертным газом, например гелием или азотом, чтобы гарантировать отсутствие кислорода, который может нежелательно окислить серу остатка Met.

После снятия защиты и нейтрализа- ции пептидную .цепь выстраивают ступенька за ступенькой на смоле. Снятие защиты, нейтргшизацию и добавление каясдой аминокислоты осуществляют в соответствии со способом по схемам А и В.

Снятие защиты предпочтительно осуществлять согласно схеме А.

Реагент

60% трифторуксусной

кислоты / 2% этандитиола

60% трифторуксусной

кислоты / 2% этандитиола

Изопентанол / 1% этадитиола

Триэтиламин (10%) в

МеОН

Триэтиламин (10%) в

CHjCl

МоОН (дважды)

(дважды)

Связьшание предпочтительно осуществлять согласно схеме В:

Реагент

Время смешивания, мин

5

0 5

5

0 5

0

5

N,N -Дициклогексилкарбодиимид-Трет-бутилоксикарбонил-аминокислота50-90

МеОН (дважды)0,5

(дважды)0,5 (3 моль/л) в

CHjCli ,15,0 .

-CHiClj0,5

МеОН0,5

(дважды)0,5

От одного до двух млмолей аминокислоты, защищенной трет-бутилокси- карбонидом, в хлористом метилене используют на грамм смолы в сочетании с одним эквивалентом 1,0 молярного 30 N,N -дициклогексилкарбодиимида в хлористом метилене в течение двух часов, При связывании трет-бутилоксикарбо- нил-Arg (толуолсульфонил) используют смесь 50% диметилформамида и хлористого метилена..Бензиловый эфир используют в качестве гидроксильной защитной группы боковой цепи для Ser и Thr. Паранитрофениловый сложный эфир используют для активации карбоксильного конца Asn или Gin, и, например, трет-бу,тилоксикарбонил-Азп (па- ра-нитрофениловый эфир) связывают в течение ночи, используя один эквивалент бутилового спирта в 50%-ной смеси диметилформамида и хлористого метилена, причем в этом случае добавляют дициклогексилкарбонид. Аминогруппу Asn или Glu защищают ксанти- лом, если вместо способа активного эфира используют дициклогексилкарбо- нильное связывание. Дихлорбензилокси- карбонил используют в качестве защитной группы для боковой цепи Lys. Толуолсульфонил используют для защиты гуандиновой группы Arg, а карбоксильную группу Gly или Asp защищают бензилом. Фенольную гидроксильную группу Tgr защищают 2,6-дихлорбензи- лом. В конце синтеза получают пептид

следующего состава X ,-Туг(X2)-Лla- -Asp(X,,)-Ala-I e-Phe-Thr(X4)-Asp(X)- .-Ser(X4)-Tyr(X7)-Arg(X)-Lys(X,)- I -Val-Leu-DAla-Glu(X5)-Leu-Ser(X4)- -Ala-Arg(Xj)-Ly5(X,)-Leu-Leu-Gln(Xj)- Asp(X )-lle-Met-Ser(XO-Arg(XJ- Gln(Xp-Gln(X5)-Gly-Glu(Xз)-Ser()- -Asn(Xi)-Gln(XJ)-Gly(Xp-Arg(X)- -Gly(Xj),

где XT - трет-бутилоксикарбонил, 2,6-дихлорбензил, Xj - бензиповьй эфир, X 4 - бензил, Xj - ксантил, Х - толуолсульфоиил, Х, - дихлорбензилок- сикарбонил, Xj - NH-смоляной носи тель. Ксантил может быть частично или полностью удален обработкой три- фторуксусной кислотой, используемой для удаления (/-аминозащитной группы.

10

15

фракций, независимо проверенных на чистоту, осуществляют с помощью гр диента GHjCN в 0,1%-ной трифторукс ной кислоте. Центральный срез зате лиофилизирутот, получают 107 млг це левого пептида, чистота которого о ло 100%. Величина оптического вращ ния чистого пептида rf D -56,3. Пример 2. GHHTCS пептида D-Aлa J- человеческий панкреатический гормональный вьвделительный фактор (1-32)-NH2, имеющего формул

H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn- -Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-D-Ala-Gln -Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Leu- -Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-6ly-N

осуществляют ступенчатым образом,

После связывания со смолой послед-20 пользуя пептидный синтезатор Бекмай 990, на параметилбензгидрилами новой смоле по примеру 1. Получают 96,5% пептида 96,5%-ной чистоты пр использовании тонкостенной хромато

него остатка Туг, трет-бутилоксикарбонил удаляют 60%-ной трифторуксус- ной кислотой в -j и получают 3,4 г зап1 1щенной пептидной смолы. Для отщипления защитных групп.с остального защищенного пептида-смолы, его обрабатывают 1,5 мл анизола, 0,5 мл метилэтилсульфида и 15 мл фтористого водорода на грамм пептида-смолы при -20 С в течение получаса и при в течение получаса. После удаления фтористого водорода под высоким вакуумом остаток смолы-пептида промывают попеременно сухим диэтиловым эфиром и хлороформом, а затем пептид экст- рагирук т обезгаженным 2 н.водным раствором уксусной кислоты и отделяют от смолы фильтрованием.

ОтщепленньБ и лишенный защиты пептид затем растворяют в 0,5%-ной уксусной кислоте и подвергают его очистке, которая может включать тонкую гель-фильтрацию на Сефадексе G-50. Получают около 1,62 г пептида.

Затем пептид подвергают дальнейшей очистке с помощью препаративной или полупрепаративной высокоэффективной жидкостной хроматографией. Кассетную установку Water Associates prep. h. G-500 заполняют на 17 микрон Gfg кремнезом, поставляемым фирмой Vudas ЗООА. Градиент CHjGN в ТЕАР создают с помощью градиентног о маркера низкого давления Eldex. Хромато- графические фракции тщательно отбирают с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии и собирают только фракции, обладакяцие значительной чистотой. Обессоливание очищенных

фракций, независимо проверенных на чистоту, осуществляют с помощью градиента GHjCN в 0,1%-ной трифторуксус- ной кислоте. Центральный срез затем лиофилизирутот, получают 107 млг целевого пептида, чистота которого около 100%. Величина оптического вращения чистого пептида rf D -56,3. Пример 2. GHHTCS пептида D-Aлa J- человеческий панкреатический гормональный вьвделительный фактор (1-32)-NH2, имеющего формулу

H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn- -Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-D-Ala-Gln -Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Leu- -Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-6ly-NHj,

осуществляют ступенчатым образом, используя пептидный синтезатор Бекмай 990, на параметилбензгидрилами- новой смоле по примеру 1. Получают 96,5% пептида 96,5%-ной чистоты при использовании тонкостенной хроматографим и высокоэффективной жидкостной хроматографии. Величина оптического вращения составляет fo/jD -57,9°.

Пример 3. Gинтeз фрагмента

человеческого панкреатического гормонального выделительного фактора, т.е. человеческого панк15еатического гормонального выделительного фактора (1- 32)-МН г, формулы

H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn- -Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln- -Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln- -Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-NH,

осуществляют ступенчатым образом, используя пептидный синтезатор Бек- ман 990, на параметилбензгидриламино- вой смоле по примеру 1. Этот аналог признан по существу чистым при использовании тонкослойной хроматографии и высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Пример Д. Gинтeз фрагмента человеческого панкреатического гормо- нального выделительного фактора, т.е. человеческого панкреатического гормонального вьщелительного фактора (1- 39)-NH j, имеющего формулу

-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn- -Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu- -Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Glu-Asp-Ile- -Met-Ser-Arg-Glu-Glu-Gly-Glu-Ser-Asn- -Gln-Gly-Arg-Gly-NH,

осуществляют ступенчатым образом, используя пептидный синтезатор Бек- ман 990, на параметилбензгидриламино вой смоле по примеру 1. Пептид признан по существу чистым при использовании тонкослойной хроматографии и высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Пример 5. Синтез пептида D-Ала - человеческий панкреатический гормональный выделительный фак- т.ор (1-39)-NH2, имеющего формулу

H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ale-Phe-Thr-Asn- -Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-D-Ala-Gln- -Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln- -Sep-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly- -Glu-Ser-Asn-Gln-Gly-Arg-Gly-NH, осуществляют ступенчатым образом, используя пептидный синтезатор Бек- ман 990, на параметилбензгидрилами- новой смоле по примеру 1, Пептид признан по существу чистым при использовании тонкослойной хроматографии и высокоэффективной жидкостной хроматографии. Проведены биологические испытания полученных соединений.

Для определения эффективности различных синтетических пептидов при стимуляции выделения гормона проводят анализы in vitro, используя в качестве стандарта синтетический человеческий панкреатический гормональный выделительный фактор

Кроме испытаний in vitro на секрецию гормона роста, проводили также эксперименты in vivo путем введения синтетического пептида через вживленный катетер в свободно бегающих нормальных самцов крыс, Ж 1вотных предварительно обрабатывают FL А-63, ингибитором допаминовой гидроксилазы, который подавляет спонтанную секрецию гормона роста, не влияя на реакцию к экзогенному гормональному выде(hpGRF(1-40)OH, поскольку он являет- ..елъному фактору. Образцы крови беся эквивалентом нативного пептида) при параллельном сравнении с эквимо- лярными концентрациями природного hpGRF(1-44)КНт и различных других

40

синтезированных аналогов.

Используют культуры, которые включают клетки -гипофиза крысы, удаленного за четыре или пять дней до этого. Культуры, которые считаются оптимальными для выделения гормона рос- 45 та, используют для сравнительного испытания. Инкубирование испытываемого вещества осуществляют в течение 3-4 ч, после чего берут аликвоты культураль- ной среды и обрабатывают, чтобы измерить содержание в них иммунрреакци- онного гормона роста хорошо известным способом, радиоиммуноанализа.

Результаты сравнительных испытаний в виде протокола приведены в таблице.

В таблице дан уровень гормона роста в образцах клеточных культур методом радиоиммунного анализа.

рут через этот же катетер непосредственно перед инъекцией и через 5 и 20 мин после HeeJ уровни гормона роста в крови измеряют с помощью радиоиммуноанализа. Результаты показывают, что синтетические пептиды, полученные предлагаемым способом, являются мощными стимуляторами секреции питуи- тарного гормона роста и сравнимы по активности с природными гормональными вьщелительными факторами.

Таким образом, проведенные испытания показали, что соединения, полученные предлагаемым способом, являются малотоксичными биологически активными соединениями, способствующими секреции гормона роста, по активнос- 55 ти они близки человеческому гормональному вьделительному фактору (1-44)Ш5, но доступнее его, поскольку содержат в своей цепи меньшее число аминокислотных остатков (32 и 39)

50

5

0

5

0

При проведении испытаний используют клетки типа PAP/GRF, Культурная среда: 2% FCS + 5 DEX(/5-PI) + Среда инкубирования: 0,1% бис-(тр1тетил- силил)-ацетамид f аскорбиновая кис- лота/HDMe;(термин FCS означает эмбриональную телячью сьгооротку DEX - дексаметазонj термин РАР означает крысиную переднюю долю гипофиза и показывает, что при испытании использовали первичные культуры клеток передней доли гипофиза крысы),

Испытания in vitro этих синтетических пептидов показьгоают, что эффективная концентрация, дающая 50%- ный эффект (, изменяется от 20 до 100-пикомолярной, а самая низкая эффективная концентрация составляет 3-8 пмоль в литре. Максимальная эффективная концентрация для человечес кого панкреатического гормонального выделительного фактора была примерно 1-наномолярной.

Кроме испытаний in vitro на секрецию гормона роста, проводили также эксперименты in vivo путем введения синтетического пептида через вживленный катетер в свободно бегающих нормальных самцов крыс, Ж 1вотных предварительно обрабатывают FL А-63, ингибитором допаминовой гидроксилазы, который подавляет спонтанную секрецию гормона роста, не влияя на реакцию к экзогенному гормональному выде ..елъному фактору. Образцы крови бе..елъному фактору. Образцы крови берут через этот же катетер непосредственно перед инъекцией и через 5 и 20 мин после HeeJ уровни гормона роста в крови измеряют с помощью радиоиммуноанализа. Результаты показывают, что синтетические пептиды, полученные предлагаемым способом, являются мощными стимуляторами секреции питуи- тарного гормона роста и сравнимы по активности с природными гормональными вьщелительными факторами.

Таким образом, проведенные испытания показали, что соединения, полученные предлагаемым способом, являются малотоксичными биологически активными соединениями, способствующими секреции гормона роста, по активнос- ти они близки человеческому гормональному вьделительному фактору (1-44)Ш5, но доступнее его, поскольку содержат в своей цепи меньшее число аминокислотных остатков (32 и 39)

и могут быть получены синтетическим путем.

Формула изобретения

Способ получения пептидов общей формулы I

H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn- -Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-nAla-Gln- -Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp -Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Q,

I

где Q - NH -i или Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-NHj,

отличающийся тем, что тpeт-бy ГилoкcикapбoншI-Gly вводят во взаимодействие с параметилбензгид- риламингидрохлоридной смолой, уда--: ляют защитную группу и затем проводят постепенное наращивание пептидной цепи в соответствии с аминокислотной последовательностью, отвечающей соединению общей формулы I, и от. полученной пептидной смолы общей формулы II

X, Туг(Xj)-Ala-Asp(Х)-Ala-Ile-Phe- -Thr(X4)-Asn(Xj)-Ser(X)-Tyr(X2)- -Arg(X)-Lys(X7)-Val-Leu-DAla-Gln(Xj)- -Leu-Ser(X4)-Ala-Arg(Xt)-Lys(X7)- -Leu-Leu-Gln(Xj)-Asp(X3)-Ile-Met- -Ser(X4)-Airg(X)-Gln(Xj)-Gln(Xp- -Gly-W,

где W - Xg или -Glu(X3)-Ser(X)- -Asn(Xj)-Gln(Xy)-Glu(X p- -Arg(Xt)-Gly Xj, X,- трет-бутилоксилкарбонил; Xj- 2,6-дихлорбензил; Xj- бензиловый эфир; бензил; Xj- ксантил Х -толуолсульфонил, Х,- дихлорбензилоксикарбонил; Xg- остаток параметилбензгидриламингидрохлоридной смолы отщепляют трет-бутилоксикарбонильную группу обработкой трифторуксусной кислотой в хлористом метилене и за- тем проводят деблокирование и отщепление полимерной смолы обработкой полученного продукта фтористым водородом в присутствии анизола.

Изобретение касается производства синтетических пептидов, в частности получения соединений общей формулы Н.ТуГ-А1a-Asp-Alа-IIe-Phe-Thr-Asn- -Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-DAla-Gln- -Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp- -Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Q, где Q NH,; или Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg- -Gly NH , которые могут быть использованы в медицине. Цель- - создание новых укороченных пептидов с низкой токсичностью, способных стимулировать выделение гормона роста. Их синтез ведут реакцией трет-бутилокси- карбонил-Gly с п-метилбензгидриламингидрохлоридной смолой с последующим удалением защитной группы и дальнейшим наращиванием пептидной цепи в соответствии с аминокислотной последовательностью, отвечающей указанной формуле. Затем от полученной пептидной смолы общей формулы X ,Tyr(Xj)- -А1а-Азр(Хз)-А1а-11е-РЬе-ТЬг(Х4)- -Asn(Xi)-Ser(X4)-Tyr(Xi)-Arg(X)- -Lys(X)-Val-Leu-DAla-Gln(Xs)-Leu- -Ser(X4)-Ala-Arg(X4)-Lys(X,)-Leu- -Leu-Gln(X5)-Asp(X3)-Ile-Met-Ser(X4)- -Arg(Xg)-Gln(Xj)-Gln(X5)-Gly-W, где W Xg или -Glu(Xj)-Ser(X)-Asn(Xj- -Gln(Xp-Glu(X5)-Arg(Xj)-Gly-Xg ; X, - тpeт-бyтилoкcикapбoнилj X - 2,6-дихлорбензил; Хз - бензиловый зфиpj X - бензил; X5 - ксантил; X,- толуолсульфоНИЛ; -, - дихлорбензил- оксикарбонил; X g - остаток п-метил- бензгидриламиногидрохлоридной смолы, отщепляют трет-бутилоксикарбонильную группу обработкой СН jCOOH в среде хлористого метилена. Далее проводят деблокирование и отщепление полимерной смолы с помощью обработки продукта HF в присутствии амизола. Новые пептиды по активности близки к человеческому гормональному вьщелитель- ному фактору (1-44)NH, но более до- ступны, т.к. могут быть получены синтетическим путем. 1 табл. а «о сл с и 1С в5 4 СП СЛ