Способ получения гибридов соматических клеток Советский патент 1983 года по МПК C12N5/02 

х

эо

4

o Изобретение относится к области нетики соматических клеток, касаетс гибридизации соматических клеток, а именно выделения гибридов. Выделение гибридов является одни из этапов способа г бpидизaции сома тических клеток. Соматическиегибри широко используются в различных обл тях биологической науки в частности в генетике, онкологи-и, вирусологии, иологии клетки, биологии развития., В последнее время сделаны первые попытки использовать гибриди зацию соматических клеток для решения важных практических вопросов (лечение рака и инфекционных заболе ваний с помощью моноклональных анти тел, синтезированных в гибридах кле ток , получение интерферента и его очистка, выведение хозяйственно важ видов, растительных гибридов).. Гибриды соматических-клеток получают слиянием двух или несколько кле ток с образованием гибр адной клетки Для этого смесь родительских клеток подвергают определенной обработке, при которой часть клеток сливается и образуются гибриды, состоящие из 2-3 родительских клеток. Следующий этап работы закдночается в выделении чистой, желательно клональной, культуры гибридных клеток из смешанной популяции. Как.правило, гибридные клетки растут медленнее родительских и составляют небольшую часть популяции, поэтому их выделение представляет значительные трудности. В настоящее время для этой цели используются два способа lj-,, неселактиБный и селективный. Неселек|тивный способ заключается в том,что единичные гибридные клетки механически вьиделялот из смеси с родительскими и получают из них клональные культуры. -Способ отличается чрезвычайной трудоемкостью, так как для того чтобы получить несколько гибридных клонов приходится выделять огромное количество клеток. Кроме то го, получение клонов из одной клетк возможно только при использовании посуды и питательных средвысшего качества. Более широко используется селективный способ выделения гибриду ных клеток, который заключается в том, что скрещивают мутантные клетки (например, дефектные по определен ным ферментам, ауксотрофные или температурочувствительные мутанты), смесь родительских и гибридных клеток культивируют в условиях, способствующих размножению только гибридны клеток (селективные среды, непермиссивная температура). Недостатком способа является то, что он позволяет скрещивать только мутантные-клет ки. Способ довольно сложен, так как требует создания селективных условий (питательные среды, температура). Кроме того, на определенном этапе при использовании этого Способа возникает необходимость в очень редком рассеве культур (1:20), во-первых, для того, чтобы избежать метаболической кооперации между гибридными и родительскими клетками, и, во-влорых, для получения клональных линий гибридных клеток, что в свою очередь требует питательных сред и посуды высшего качества. Целью изобретения является улучшение воспроизводимости и снижение трудоемкости способа, . Для достижения цели в- способе получения гибридов соматических клеток путем скрещивания родительских клеток, выращивания на питательной среде монос-лоя, состояц его из смеси родительских и гибридных клеток, рассева смешанных культур, удаления из культуральных флаконов родительских клеток и.культивирования оставшихся гибридных клеток до образования колоний.рассев клеток производят при соотношении 1:3-1:5 удаление из кулБтуральных флаконов родительских клеток осуществляют путем обработки смешанных культур раствором трипсина при 36-38 С в течение 1-5 мин с двух-трехкратным повторением в течение 2-3 недель после скрещивания до полного удаления всех родительских клеток. Пример- 1. Выделение соматических гибридов при скрещивании в мо нослое перевиваемых клеток мыши Bag и диплоидшах/фибробластов человека, В качестве родительских клеток берут перевиваемые клетки опухоли мыши и диплоидные эмбриональные фибробласты человека. Обе культуры снимают со стекла при пассаже с помощью 0, раствора трипсина при 37®С в течение 1-2 мин. После слияния родительских клеток в монослое .путем обработки их раствором полиэтиленгликоля, смешанные культурыв течение 24 ч культивируют в среде Игла с 10% бычьей сыворотки. Затем монослой рассаживают из расчета 1:3 или 1:5, Через 2-3 дня в культурс1х образуется монослой, состоящий из родительских мышиных, родительских человеческих клеток и гибридов, полученных от их скрещивания, .Для удале,ния родительских клеток из смешенных культур их обрабатывают 0,25%-ным раствором трипсина при 36зё С в течение 1-2 мин... Отщепившиеся при обработке трипсином родителькие клетки и те гидриды, степень адгезивности которых близка к родительской, смыва ют со стекла сррдой и удаляют из культуральных флаконов. Гидриды с большей чем у родительсних клеток, адгеэивностью, при этом ортаются на стекле. Их заливают средой Игла с 10% бычьей сыворотки и культивируют до образования моносло§, после чего обрабатывают трипсином, как описано выше. Для полного удаления родительских клеток из популяции достаточно обработать трипсином смешанные культуры после слияния 2-3 раза. В результате на стекле культурального флакона остаются отдельные колонии Г-идридных клеток. Казвдая колония представляет собой потомство одной гидридной клетки. Для получения клональных линий каждую колонию отдельно снимают со стеклапутем обработки смесью равных количество О,5%-ного раствора трипсина и 0,04%-нЬго раствора версена при 37°С в течение 3-4 мин и культи; вируют в среде Игла с 10% бычьей сыворотки.

Способ основан на том, что часть образовавшихся при скрещивании в

монослое гибридных клеток обладает большей ёшгезивностью, чем обе родительские культуры. Благодаря этому родительские клетки могут быть удалены из культуральных флаконов посредством мягкой, обработки трипсином, а гибриды с большей адгезивностью остаются на стекле и используются для получения чистых культур. Кроме того, присутствие в культурах

0 небольшого постепенно уменьшаинцегося :количества родительских клеток в- те-, чение 2-3 недель после слияния кон- диционирует питательную среду, что способствует лучшему выживанию и размножению отдельных гибридных клеток,

5 которые образуют на стекле флакона колонии, представлякмцие собой потомство одной КЛетки. К времени полного удаления родительСких клеток из культур гибридные колонии достигают достаточно большого размера и могут быть использованы для получения кло нальных линий ги.бридных клеток.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГИБРИДОВ СОМАТИЧЕСКИХ Ю1ЕТОК путем скрещивания родительских клеток, выращивания на питательной среде монослоя, состоящего из смеси родительских и гибридных клеток, рассев смешанных культур, удаления из культуральных флаконов родительских клеток и культивирования оставшихся гибридных клеток до образования колонии, отличающий .с я тем, что, с целью у лучшения воспроизводимости и снижения трудоемкости способа, рассев клеток производят при соотношении 1:3-1:5, удаление из культуральных флаконов родительских клеток осуществляют путем обработки смешанных культур раствором трипсина при 36-38с в течение 1-5 мин двух-трехкратным повторением в течение 2-3 недель после скрещивания до полного удаления всех ро-дительских клеток. (Л с