Способ получения гибридных клеток Советский патент 1985 года по МПК C12N15/00 C12N5/00 C12N5/02 

Изобретение относится к медицине, «5иЬлогии, сельскому хозяйству, иммунологии, в частности к генетике соматических клеток. Метод гибридизации соматических клеток в последние годы приобрел ирключительно важное значение при решении практических и теоретических задач биологии, медицины к сельского хозяйстба. Он используется для ка тирования локализации генов в хромосомах, для анализа регуляции генов в клетках эукариотов, изучения механизмов контроля роста и дифферен цировки клеток в процессах развития зародьшей, заживлении ран, образовании опухолей. Пр именение этого метода в медицинской практике расширяет возможности генетического консультирования, выявления латентных опухолеродных вирусов, проверки опухолевы клеток на присутствие в них онкогенных вирусов. Наконец, гибридизация клеток лежит в основе получения гибридом продуцирующих моноклональные актитела, которые находят разнообраз ное применение в иммунологии и биоХШ4ИИ. Известен способ получения гибридных клеток, в котором используется селективная система, характеризующая ся тек, что в.ней маркируется одна родительская клетка, представляющая собой двойной мутант, устойчивый как к тиогуанину, и к уабаину (Уа). При слиянии такой мутантной клетки с но1 1альной клеткой, чувствительной к уабаину ГГФРТ, Уа), образуются гибриды, способные ; расти в селективной среде, содержащей гипоксантин, аминоптерин и тимидин, так называемой среде ТАТ, в которую также добавлен уабаян. Родительские клетки в этих условиях элимини ,руются О. Наиболее близким к изобретению по технической сущности и достигаемому результату является способ получения гибридных клеток с помощью выращивания мутантных клеток, устой чивых к азагуанину (АГ) (в клетках отсутствует фермент ГГФРТ) и бромдезоксиуридину (БУдР) (в клетках отсутствует фермент тимидинкиназа ТК), их слияния с применением полиэтиленгликоля (ПЭГ) или вируса Сендай и выращивания на селективной среде ГАТ, где родительские мутантные клетки погибают, а гибридные выживают С2j. Недостатками известных способов являются необходимость получения и выращивания мутантных клеток, длительность процесса получения и изучения мутантных клеток, необходимость использования дорогостоящих биологически активных веществ. Цель изобретения - упрощение способа и сокращение во времени. Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения гибридных клеток, включающему слияние клеток, элиминацию родите1п ских клеток, последующее выращивание и клонирование гибридных клеток, элиминацию родительских клеток проводят последовательным использованием интерферонов и цитоцидных вирусов. Способ осуществляют следующим образом. Родительские клетки скрещивают, вьфащивают на питательной среде до монослоя, состоящего из смеси родительских и гибридных клеток, удаляют из культурапьных флаконов клетки сначала одного родителя, а затем другого и культивируют оставшиеся клетки до .образования колоний. Для скрещивания используют интерферончувствительные клетки родительских линий. Удаление родительских клеток производят путем последовательной обработки сначала интерфероном, специфическим для одного ввда родительских клеток, и заражения цитоцидным вирусом, элиминйфуя таким образом родительские клетки другого ввда, и далее, после отмывания культуры, внесением в нее интерферона, специфического для второго вида клеток, заражением цитоцидным вирусом, который элиминирует родительские клетки первого вида, в результате чего сохраняются лишь гибридные клетки. / Пример. Выделение гибридных клеток при скрещивании в суспензии перевиваемых клеток мыши L и перевиваемых человеческих клеток J... Для слияния используют культуру человеческих клеток J-96, чувствительную к человеческому лейкоцитарному интерферону, и линию мышиных клеток Laja чувствительную к действию мышиного интерферона. Слияние проводят с: помощью 50%-ного раствора ПЭГ-1550. Снятые трипсином и отмытые клетйи J-96 в количестве 6 10 и Uj29 количестве 9-10 перемешивают, центрифугируют 10 14ин при 250jg;-, надосадок отсасывают и . на клетки наслаивают 1 мл раствора ПЭГ, перемешивают легким потряхиванием 80 с, кваащы промывают средой . 199 с последуюпщм центрифугированием и высевают во флаконы или чашки Петри из расчета 310 клеток/мл с 20% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота (КРС), через 2 ч меняют среду на свежую того же состаЬа. .

Полученная в результате слияния смесь клеток состоит из родительских клеток обоих вцдов и двух групп многоядерных клеток: гомокарионов, содер ащих ядра одного типа клеток, и гетерокарионов (или гибридных клеток), содержащих ядра обоих родительских типов. Для избирательного выделения и размножения гибридных клеток необходимо добиться гибели всех названных типов клеток, кроме гетерокарионов. Через 18 ч среду заменяют на среду 199 с 2% эмбриональной сыворотки КРС с добавлением мьш1иного интерферона из расчета 50 ед/мл. Через 6 ч вводят вирус везикулярного

.стоматита (BBC) из расчета 2-10 Через 18 ч, т.е. после- гибели человеческих клеток и гомокарионов, не несущих рецепторов к мышиному интерферону, клетки отмывают от вируса раствором Хенкса (или освобождаются от вируса введением антисыворотки) . Заливают среду 199 с 20% эмбриональной сыворотки КРС с добавлением человеческого лейкоцитарного интерферона из расчета 80 МЕ/мл. После б ч вводят вирус ВВС из расчета 2 -10 . Через 18 ч клетки отмывают от вируса раствором Хенкса (или освобождаются от вируса введением антисыворотки) и запивают средой 199 с 20% эмбриональной сыворотки

|КРС с добавлением глютамина.Колонки гибридных клеток, появляются через 2 недели, их реклонируют и размножают 11редлагаемый способ позволяет получить гибриды соматических клеток.

.Метод применим как для получения межвидовых гибридных клеток, когда родительские культуры чувствительны к интерферону, так и для получения внутривидовых гибридов в случае,

.если один из родительских партнеров не чувствителен к интерферону .

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГИБРИДНЫХ КЛЕТОК, включающий слияние клеток, элиминацию родительских клеток, последующее выращивание и клонирование гибридных клеток, отличающ и и с я тем, что, с целью упрощения способа и сокращения во времени, элиминащоо родительских клеток проводят поеледов1ательным использованием интерферонов и цитоцидных вирусов.