Способ окрашивания нервной ткани Советский патент 1983 года по МПК G01N1/30 A61B10/00 G01N33/48 

(54) СПОСОБ ОКРАШИВАНИЯ НЕРВНОЙ ТКАНИ

1

Изобретение относится к области меди цины, а именно к гистологии.

Известен способ окрашивания нервной ткани метиленовым синий на фосфатном буфере путем погружения, нанесения и перфузии красяшего раствора хлористого метиленового синего в изучаемый орган с последуюшей фиксацией краски 11

Недостатком этого способа является затруднешшя дифференхшровка нервных окончаний от pepy taioiiaix тканей.

Волее совершенным 5тляется способ окрашивания нервной тканв путем обработки ее строго изотоническим раствором метиленового синего в кислой среде при рН ниже 7,0, основанный на том, что нервная ткань в квелой среде дольше арутлх. тканей удерживает метиловый синий. Он заключается в том, что слоя ный раствор при концентрации «фасит ля О,,р;35% доставляемся в ткани с током крови в избыточном количестве для окраски, всех тканей, а затем крас тель вымывается из нервных сканей

И оставшийся быстро фиксируется. Изотоничность создается хлористым натрием, постоянство рН.- О,ОО1 М раствором фосфатного буфера. Для лучшего выявления нервных структур в красящую смесь добавляют разли |ные вешес1ва - акцепторы водорода, а также глюкозу, пировиноградноквеслый натрий, соли магнвя. Сложный красящий раствор (количество подбирается опытным путем) под давИ

10 ннем, близким к артериальному, вводят в артерии наркотизированного животного в течевие 5-20 мин. Затем обнажа ют исследуемый участок, быстро вырезают и переносят в дифференцирующую .

15 смесь - тот же раствор, но без красвн теля в под контролем микроскопа в течение 5-15 мин следят за нсчезновенвем окваскв нервных тканей до оптимальной степени яркости нервных элементов,

20 после чего препарат немедленно погружают в фиксатор из смеси роданида аммсжия и пикрщсовок1{слого аммония 2.

К недостаткам способа относится лабильность окраски вследствие быстрохх обесцвечивания, что затрудняет диффере цировку нервных волокон.

Целью изобретения является улучшени дифференцировки нервных окончаний от окружающих тканей.

Поставленная цель достигается тем, что при осуществлении способа окрашивания нервной ткани путем ее обработки метиленовой синью последнюю берут в концентрации М - на 0,1-0,25 М фосфатном буфере, при этом в процессе обработки рН раствора постепенно увеличивают от 4,5 до 7,0.

Способ осуществляют следующим образом

.Для окрашивания берут орган или кусочек органа только что -забитого живот ного (мочевой пузырь лягушки, пищевод белой мыши, тонкую кишку черепахи). Апплщируют красящий раствор в условия ромиатной температуры (). Оптимальным является раствор, содержащий хлористый метиленовый синий (выпускаемый Московским алкалоидным заводом, МВ-391) в концентрации 2,5 10 М, растворенный O,i-0,2 М фосфатным буфером. Значения рН раствор увеличивают от порции к порции от 4,5 до 7. В 265 опытах были- выявлены все типы нервных окончаний мочевого пузыря Л51гуш1да через 7 мин после начала аппликации раствора.Для сведения к минимуму недостатков фиксации химическими веществами . (выявление волокон соед щительной ткани, перераспределение окраски, вымывание окраски при обезвоживании и др.) фиксируют окраску путем высушивания воздухом 10-1,5 мин.

Проверка опытным путем показала, что хорошие результаты получают при окрашивании раствором концентрации (1-3) М. Оптимальной концентрацией является 2,5х10 М. Более высокие концентрации наряду с нервной тканью интенсивно окрашивают и окружающие, а слишком высокие не позволяют вьщелить нервную ткань, закрашивая весь фон.

Низкая мол5фность раствора (0,О1 М вызьПзает варикозности, повреждения волокон и прекращение их окраски, а также неравномерность окрашивания разных участков органа и ткани. Точност красящего раствора повидимому является одним из основшлх факторов удачной окраски и колеблется от 0,1 М до 0,25 М

Так О, О5-О,08 М вызьтает неполную окраску нервных волокон и ЕЖ окончаний мочевого пузыря лягушки, О,2 М прекрасно выявляет нервные элементы, а Р,3-0 4 М дает постепенное ослабление окраски.

Подбор рН раствора осуществляют иоходя из того, что все типы нервных волокон и их окончаний (рецепторы, преганглионарные волокна с синапсами, вегетативные волокна) наибол1эе полно и градуально выявляются при рН от 4,5 до 7,0. Разные типы нервных окончаний нервных клеток и тканевых эле/лентов выявляются при определенных значениях рН. По максимумуинтенсивноститн полноты выявления тех или иных структур в условиях возрастания рН нервные элементы исследованных-.обьектов располагаются в следующем порядке; рецепторы централного происхождения; безмякотные волокна с окончаниями; аксоны местных нейронов; преганглионарные волокна. Так, наиболее полная интенсивная избиратель ная окраска рецепторов мочевого пузыря лягушки наблюдается при ,5-5,О; безмякотные волокна выявляются при рН 5,8-6,0; синапсы при ,4-7,О. У черепахи рецепторы центрального происхождения выявляются при ,5- -4,6; волокна и окончания вегетативного сплетения при ,8-6,6; аксоны местных нейронов при ,2-6,4; дендриды при рН 6,9. В пищеводе белой мыши рецепторы выявляются при более высоком значении ,9; моторные бляшки при ,2; синапсы при ,2; волокна вегетативных сплетений при ,О-6,2.

Это, однако, не означает, что. каждый тип нервных окончаний может быть i выявлен только при одном значении РН. Часть окончаний выявляется и при других значениях. Окружающие фон тоже имеют рН - выявляемую характериотику, особенно, при рН выше 7,0. Поэтому метиленовый синий апплицируют порциями, равномерно повышая рН от 4,5 до 7,О.

Предлагается оптимальное окрашивание при температуре . Проверка Г влияния различных температур показала, что низкие температуры (4-17С) замедляют окрашивание, в то время как высокие (37-42°С) у холоднокровных (л гушки) ускоряют ее, но одновременно выаьшают неравномерную окраску участками. Для теплокровных (пищевод белой мыши,золотистого хомичка) также не рекомендуется текшература окрашивания выше . После интенсивного выявления всех типов нервных окончаний через 7-15 ми от начала окрашивания (при этом продол жительность зависит от толщины препарата и плотности ткани) удаляют избыто раствора и сушат препарат до/полного Высыхания оптимально при температуре 25-ЗОС в течение 1(-15 мин на воздухе. В результате такого высушивания метиленовый синий химически не изменяется, сохраняя при этом все оттенки цвета, присущие окраски in v-ivo . При . высоких температурах начинается разлоч жение метиленового синего. Однако боле толстые препараты можно сушить на устройстве для парафиновых срезов в термостате при 37-42° С. Если препарат высушен не до конца, он со времене обесцвечивается. Поэтому полное высуши вание препарата необходимо. Краситель гигроскопичен в при этом способен к обесцвечиванию под действием света. После высушивания следует обычное ироо ветление ксилолом и заключение в да марову смолу. Существенна свежесть материала, так как примерно через 1-1,5 ч пережи вания энергетический уровень обмена в ткани падает. Пример. Мочевой пузырь Л51гу ки. Мочевой пузырь разрезают в юбласти лопастей, чтобы ригидное кольцо шейки было сохранено и осторожно расправляют на предметном стекле. -Прикрепив края разреза к стеклу (во избежание сокращений при окрашивании) апплицируют красящий раствор порциями, равномер но повышая рН от 4,5 до 7,0, в течение 7 мин (лучше в затененных условия затем осторожно (промокательной ) удаляют избыток краски и 1015 мин сушат на воздухе (25-ЗО°С). После этого просветляют в ксилоле и заключают в даммарову смолу. П р и м е р 2. Тонкая кишка черепа хи. Участок неразрезанной кишки, распра ленный рамочкой, трубочкой, заполнением или закреплением иглами окрашивают такж как и мочевой пузырь лягушки, но удлиняют время аппликации красителя до 15 мин, а сушку до 2О-ЗО мин. Перед сушкой разрезают, отделяют от слизистой оболочки (так как она способствует обеоцвечиванию окраски и замедляет высушивание) и осторожно расправляют на рредметном стекле. 9 1« П р и м е р 3. Пшцеаэод белой мыши, олотистого хомячка. Пищевод окрашивают 7 мин в расправленном состоянии (одетым на рамочку, трубочку, заполненный или закрепленный на концах во избежание сокращения), не разрезав также как: и мочевой пузырь лягушки. Затем разрезают, отделяют от слизистой оболочки, расправляют на предметном столике, сушат 2О-ЗО мин, просветляют и заклкзчают; Во всех случаях выявляются нервные окончания. Раствор красителя: 10 мл 0,2 М фосфатного буфера (а для тонкой кишки черепахи 0,1 М) порциями рН от 4,5 до 7,О и 1 мг хлористого метиленового синего. Преимущества описьтаемого способа . в обеспечении 100%-ного выхода качеств венных препаратов, простоте методики, сокращении времени окрашивания, стабильности результатов, исключении вредного воздействия света, так как отпадает необходимость в микроскопировании. Распределение красителя в препарате соот ветствует прижизненному,а также ликвидируется возможность выявления волокон соединительной ткани, вызванная фиксацией и затрудняющая дифференцировку нервных волокон. Обеспечиваются стабильные условия выявления нервных оконча- кий всех типов, получена возможность предотвращения обесцвечивания метиленового синего. Все вышеперечисленное дает возможность исследования окраски, полностью соответствующей прижизненной, что особенно важно для проведения качественной и количественной обработки материала. Кроме того, за счет исклю . чения фиксации молибденовокислым аммениём. и обезвоживания проводкой через абсо- лютный этиловый спирт значительно со1фащается время процесса и отпадает необходимость в реактивах. Формула изобретения ; Способ окрашивания нервной ткани путем ее обработки метиленовой синью, отличающийся тем, что, с целью улучшения дифференшфовки нер&ных окончаний от окружающих тканей, метиленовую синь берут в концентрации IxlO -5 М - 3 «10-5 jv на 0,1-О,25 М фосфатном буфере, при этом в процессе ефаботки рН раствора постепенно увеличивают от 4,5 до 7,0.

7,-saesei8

Источники внформаонв,. Шабадаш А, Л. Теория и

щ внатые во ьвимание при экспертваепрактика прижизненной окраски нерв1. /шллв Р. Патогистологвческаяной системы метилеиовым синим,

техника и практическая пкугохимия, М.,Горький, Медицина, 1939, с. 44 (проМир. 1969, с. 57;-57а.тотип).