Способ окраски нервных клеток Советский патент 1984 года по МПК G01N1/30 A61B10/00 

О Изобретение относится к медицине в частности к области исследования нервной системы. Известен способ окраски нервных клеток путем суправитальной окраски метиленовым синим с последуняцей докраской азотнокисльм серебром ClJ. Недостатком способа является невысокое качество окраски тела нервной клетки. Наиболее близким по технической сущности является способ окраски нервных клеток, включающий инъекцию в нейроны водного раствора соединений кобальта, последукицую инкубацию и фиксацию, приготовление препа рата и контрастирование красителя(2 Недостатком способа является неустойчивость окраски нервных клеток вследствие появления при инкубации серо-бурого фона от сульфида аммони Цель изобретения - повышение качества окраски нервных клеток. Указанная цель достигается согла но способу окраски нервных клеток, включающему инъекцию в нейроны водн .го раствора соединения кобальта, последующую инкубацию и фиксацию, приготовление препарата и контрасти рование красителем, при котором инкубацию и фиксацию проводят одновре менно в растворе, содержащем насыщенный раствор о -нитрозо- -нафтола и альдегидный фиксатор при рН 7,4-7,5, далее препараты дополнительно фиксируют в альдегидном фиксаторе, а контрастирование проводят гемалауном. Способ осуществляют следующим образом. В эксперименте изолирзтот центральную нервную систему, например, моллюска Lyranaca stag nalis. Выбирают нервные клетки, в которые инъекцируют водньШ раствор хлористо го кобальта путем его пассивной диффузии через перерезанные периферические отростки нервной клетки. Далее нервные клетки прУомывают в двух сменах физиологического раст вора. Фиксацию и инкубацию осуществляют в растворе, содержащем насьвценны pacTBOji о6-нитрозо-/ -нафтола и альдегидный фиксатор при рН 7,4-7,5, затем препараты дополнительно фикси руют в глютаровом альдегиде и пара.форме, промывают в фосфатном буфере и докращивают гемалауном, приготавливают срезы, которые заключают в даммарову смолу. Пример 1. В нервные клетки изолированной центральной нервной системы моллюска (Ljrmn аса staglis) размером 1,5-3 мм, вводят водный раствор хлористого кобальта. Введение проводят при 14°С в течение 1сут. Промывку осуществляют в двух сменах физиологического раствора, в каждой по 2 мин. Промь1Тые препараты помещают в инкубационный раствор, состоящий из о6-нитрозо-|13-нафтола на буферной смеси, содержащей 0,4% параформ и 1,0% раствор глютарового альдегида при рН 7,4. Температура фиксации 30С Инкубационный раствор готовят следукнцим образом. Раствор А. В 40 мл подогретой дистиллированной воды растворяется 400 мг параформа. Раствор Б. К раствору А добавляется 200 мг рС.-нитрозо- нафтола. Раствор подогревается при постоянном помешивании до полного растворения 0 -нитрозо- -нафтола. Раствор В. Раствор Б доливается до 95 мл фосфатным буфером с рН 7,5. Раствор Г. К раствору В добавляется 5 мп 25% глютаральдегида, и фильтруется через вату. Время инкубации зависит от размера. препарата, критерием оценки служит появление ярко-алой окраски нейронов.- -Для нейронов размером 1,5-3,0 время инкубации составляет 10-15 мин. Далее препараты переносят в фиксатор состояпщй из 0,5% раствора параформа и 1,0% раствора глютарового альдегида при рН 7,4, на 4 ч. Промывку пре-. парата проводят в фосфатном буфере того же рН в течение 1ч. Промытые препараты помещают на 12-24 ч в 20%-ный растщор сахарозы на фосфатном буфере с рН 7,4, приготавливают замороженные срезы, которые докрашивают гемалауном, обезвоживают в возрастакяцих концентрациях изобутиловдго спирта и заключают в даммаровую смолу. , . Пример 2. Готовятпрепараты нервных клеток изолированной центральной нервной системы, размером 4,0-7,0 мм (моллюска И elis vulgaris L). Введение хлористого кобальта осзтцествляют при 14°С в течение 2сут. 3 10830 Промывку осуществлйют в трех сменах физиологического раствора, в каждой по 3 мин. Промытые препараты помещают в инкубационный раствор, как в примере 1, Время инкубации составляет 1520 мцн. Дофиксацию проводят в буферных растворах альдегидов в течение 10 ч. Последующую промывку осуществляют10 в течение 3ч. Отмытые от фиксирующей смеси препараты быстро обезвоживают в возрас-. тающих концентрациях изобутилового спирта. Затем переносят в две сме-is ны смеси (1:1) 99,5%-ного изобутилового спирта и хлороформа, ai 5 мин в каждой помещают на 10 мин в хлороформ и затем на 3 ч смесь хлоро954форма с парафином при 37С (1:1). Потом из препаратов приготавливают срезы, которые подкрашивают гемалауном по стандартной прописи, получения целлоидиновых срезов отмытые от фиксирующей жидкости препараты проводят по стандартному методу. Применение предлагаемого способа повьппает качество окраски нервных клеток вследствие улучшения дифференцировки клеток от окружакицих тканей, а также повьлиения стойкости.окрашивания, Способ нашел применение при ис следовании принципов формирования рефлекторных актов нервной системы и вопросов адаптивного поведения.

СПОСОБ ОКРАСКИ НЕРВНЫХ КЛЕТбК, включакищй инъекцию в нейроны водного раствора соединения кобальта, последующую инкубацию и фиксацию, приготовление препарата и контрастирование красителем, отличающийся тем, что, с целью повышения качества окраски, инкубацию и фиксацию проводят одновременно в растворе, содержащем насьпденный раствор оС-нитрозо- -нафтола и альдегидный фиксатор при рН 7,4-7,5, далее препараты дополнительно фиксируют в альдегидном фиксаторе, а контрастирование проводят гемалауном.