Способ определения активности церулоплазмина Советский патент 1983 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к биологической химии, в частности к способу определения активности ферментов.

Известен способ определения активности церулоплазмина в биологическом материале путем ингибирования гидроксиламином реакции превращения п-фенилендиамина церулоплазмином l.

Однако известный способ является трудоемким, а гидроксиламин высоко токсичен и взрывоопасен. Кроме того, ингибирующее действие его на церулоплазмин недостаточно выражено.

Целью изобретения является повышение точности и упрощение способа.

Эта цель достигается тем, что согласно способу определения активности церулоплазмина в биологическом материале путем ингибирования реакции превращения п-фенилендиами- на церулоплазмином в качестве ингибитора используют сульфит натрия.

Для реализации способа используют реактивы: 0,1 М ацетатный буфер (рН 6,0) , 0,5%-ный раствор солянокислого п-фенилендиамина в дистиллированной воде, 0,25%-ный раствор сульфита натрия безводного в дистиллированной воде, н-бутиловый спирт, насыщенный ацетатным буфером.

Готовят на холоде 5%-ный гомоге- нат исследуемой ткани в ацетатном буферном растворе. В три пробирки (одну контрольную и две опытные) вносят по 2 мл гомогената, в контрольную прибавляют- 1 мл 0,25%-ного раствора сульфита натрия и взбалтывают ее содержимое. Во все пробирки вносят по 1 мл раствора п-фенилен10диамина, встряхивают и помещают их. в водяной ультратермостат с температурой 37°С на 60 мин, взбалтывая ; их через каждые 2-5 мин. При этом церулоплазмин взаимодействует с

15 п-фенилендиамином и превращает его в продукт синего цвета. По истечении 1 ч во все пробирки приливают . по 7 мл н-бутйлового спирта, в результате чего останавливается фермен20тативная реакция в опытных пробирках. Пробирки закрывают пробками, интенсивно встряхивают их 30 с, помещают в ледяную баню на 10 мин, после чего центрифугируют со скоростью

25 1500 об/мин в течение 10 мин, отсасывают верхнкио бутаноловую фазу, переносят ее в.кювету с толщиной рабочего слоя 10 мм и колориметрируют на ФЭК при длине световой волны

30 582 нм (фильтр №7). 399130 Для выражения активности церулоплаэмина в условных единицах среднюю арифметическую величину экстинкции. полученную при колориметрии двух параллельных опытных проб против контроля, умножают на 100 и делят на количество миллиграммов белка, содержащегося в 2 мл внесенного в пробу гомогената, .е. в 100 мг ткани. Содержание белка определяют биуретовым способом.10 Предложенный ингибитор в 17-128 раз менее токсичен, чем солянокислый гидроксиламин, не вызывает кожных заболеваний, не взрывоопасен, обладает в 200 раз большей способностью 15 ингибировать реакцию превращения п-фенилендиамина церулоплазмином, | дешевле известного ингибирота и более доступен в приобретении. 34 Формула изобретения Способ определения активности церулоплазмина в биологическом материале путем ингибирования реакции превращения п-фенилендиамина церулоплаэмином, отличающийс я тем, что, с целью повышения точности и, упрощения способа, в качестве ингибитора используют сульфит натрия. Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1- Ярмольчук Г.М., Руснак И.К. Количественное определение активности церулоплазмина в тканях крыс,Украинский биохимический журнал, 1979, т. 51, № 2, с. 177-178.