ШТАММ БАКТЕРИЙ BACILLUS SPHAERICUS-ПРОДУЦЕНТ РЕСТРИКТАЗЫ BSH 45 I Российский патент 1994 года по МПК C12N9/14 C12N1/20 

Изобретение относится к биотехнологии и генной инженерии, в частности к получению штамма, используемого для выделения эндонуклеазы рестрикции (рестриктазы), узнающей и расщепляющей последовательность нуклеотидов 5^'-G(A/T)GC(A/T)C-3'.

Рестриктаза данной специфичности может быть использована для работ по клонированию, физическому картированию субстратных ДНК. Данная рестриктаза является удобной моделью для изучения специфичности белок-нуклеиновых взаимодействий.

Наиболее близким к заявляемому штамму-прототипом является штамм Bacillus brevis (ВКПМ В-4906) - продуцент сайт-специфической эндонуклеазы рестрикции Bbv 12 I, узнающей и расщепляющей последовательность 5^'-G(A/T)GC(A/T)C-3^'. Штамм хорошо растет на агаризованной среде отечественного производства, приготовленной на основе 3,7% гидролизата кильки. Биомасса лизируется лизоцимом. Основным недостатком данного штамма является недостаточно высокий выход фермента - 6000 ед/г сырой биомассы.

Целью изобретения является выявление штамма-продуцента, синтезирующего рестриктазу, способную узнавать и расщеплять последовательность неклеотидов 5^'-G(A/T)GC(A/T)C-3^', с повышенным выходом целевого фермента.

Цель достигается получением штамма Bacillus sphaericus 45 - продуцента сайт-специфической рестриктазы Bsh 45 I.

Новый штамм выделен из природного материала (почвы) в результате систематического поиска штаммов-продуцентов эндонуклеаз рестрикции в роде Bacillus.

Рестриктаза из Bacillus sphaericus 45 названа Bsh 45 I согласно общепринятой номенклатуре.

Штамм Bacillus sphaericus 45 характеризуется следующими признаками:
Культурально-морфологические признаки: на среде МПА и РА образует слегка выпуклые колонии с ровными краями. Клетки палочковидные, размеры 1,6-2,5 мкм длины и 0,6-0,8 мкм ширины. Образуют эндоспоры сферической формы, в раздутом спорангии в основном терминального или субтерминального расположения. Аэробы.

Физиолого-биохимические свойства: Каталазоположительные. Не гидролизуют тирозин и крахмал, не образуют индол и H₂S, реакция Фогес-Проскауэра отрицательная, не дает роста в анаэробных условиях и при 50^оС. Углеводы и спирты (глюкозу, арабинозу, ксилозу, маннит и др. ) не ферментирует.

Хранение штамма осуществляют под вазелиновым маслом в фильно высушенном состоянии или в 30% глицерине при -70^оС.

Для глубинного культивирования биомассы применяют среду следующего состава: (г/л) Рыбный гидролизат 37 Вода Остальное.

Культивирование проводят при 30^оС с хорошей аэрацией до достижения стационарной фазы роста. Выход рестриктазы Bsh 45 I - 30.000 ед/г сырой биомассы.

Полученная рестриктаза Bsh 45 I характеризуется следующими свойствами:
- узнает и расщепляет последовательность нуклеотидов 5^'-G(A/T) GC(A/T)C-3^';
- оптимальное значение рН для действия рестриктазы 7,9-9,0;
- оптимальная температура действия 37^оС;
- для активации рестриктазы требуются ионы Mg²⁺, оптимальная концентрация 5-15 мМ.

Определяющими отличиями предложенного штамма Bacillus sphaericus 45 являются:
- штамм содержит одну сайт-специфическую рестриктазу Bsh 45 I, способную узнавать и расщеплять нуклеотидную последовательность 5'-G(A/T)GC(A/T)С-3';
- продуктивность штамма в 5 раз превосходит по целевому ферменту штамм-прототип.

П р и м е р. Культуру хранят в косяках под вазелиновым маслом. Перед началом работы клетки пересевают бактериологической петлей на твердую агаризованную среду (3,7% СПА). Чашки Петри помещают в термостат на 30^оС. После 24-часовой инкубации подросшие клетки пересевают в колбы со свежей питательной средой, состоящей из 3,7% гидролизата кильки, и помещают в термостат на ночь. Ночную культуру штамма Bacillus sphaericus 45 засевают в жидкую питательную среду, состоящую из 3,7% гидролизата кильки, остальное вода. Культивируют в термостатированных качалках при температуре 30^оС, при 200 об/мин до достижения стационарной фазы роста. Клетки осаждают центрифугированием при 4^оС. Выход биомассы составляет 6 г/л культуральной жидкости. Выделение осуществляют по методике Bickle, Pirota, Imber. Выход фермента составляет 30.000 ед/г сырой биомассы. Удельная активность рестриктазы Bsh 45 I составляет 10.000 ед/мл. Фермент хранится при -20^оС в глицерине.

Полученный штамм по сравнению с прототипом характеризуется значительно более высоким выходом фермента (30.000 ед/г вместо 6.000 ед/г), т. е. в 5 раз и продуцирует только одну рестриктазу.

Поскольку рестриктаза Bsh 45 I имеет сайт узнавания, идентичный сайту узнавания рестриктазы Bbv 12 I (прототип), а выход фермента при культивировании на одинаковых средах выше в 5 раз, то Bsh 45 I может заменить прототип во всех генноинженерных исследованиях. (56) Brown N. L. Mc. Clealland M. , Whitehead P. R. Hgi AI: a restriction endonuclease from Herpetosiphon giganteus HP 1023. Gene. 1980, v. 9, p. 49-68.

Авторское свидетельство СССР N 1694647, кл. С 12 N 9/14, 1990.

Использование: биотехнология и генная инженерия. Сущность изобретения: штамм бактерий Bacillus sphaericus ГИСК им. Л. А. Тарасевича N 209 выделен из почвы в результате систематического поиска штаммов- продуцентов рестриктаз в роде Bacillus. Рестриктаза Bsh 45 I узнает и расщепляет последовательность нуклеотидов 5′ G (A/T) GC (A/T) C-3′. Штамм растет на простой дешевой однокомпонентной среде на основе рыбного гидролизата при 30С с хорошей аэрацией до достижения стационарной фазы роста. Выход целевого фермента составляет 30.000 ед/г сырой биомассы. Удельная активность рестриктазы Bsh 45 I составляет 10000 ед/мл.

Штамм бактерий Bacillus sphaericus ГИСК N 209 - продуцент рестриктазы bsh 45 I.