ШТАММ БАКТЕРИИ BACILLUS STEAROTHERMOPHILUS - ПРОДУЦЕНТ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ РЕСТРИКЦИИ, УЗНАЮЩЕЙ И РАСЩЕПЛЯЮЩЕЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ НУКЛЕОТИДОВ 5'-GGTNACC-3' Российский патент 1998 года по МПК C12N9/14 C12N1/20 C12N9/14 C12R1/07 

Изобретение относится к микробиологической промышленности и генной инженерии и касается получения нового штамма, продуцирующего сайт-специфическую эндонуклеазу, способную узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов 5'-GGTNACC-3'.

Рестриктаза такой специфичности может быть использована для исследования первичной структуры ДНК, физического картирования различных геномов. Данная эндонуклеаза является удобной моделью для изучения специфичности белокнуклеиновых взаимодействий.

Известен штамм Enterobacter cloacae, продуцирующий рестриктазы EcaI и EcaII (сайты узнавания 5'-GGTNACC-3'и 5'-CCWGG-3', соответственно) [1]. Основными недостатками данного штамма являются: в одной биомассе находятся 2 рестриктазы, что затрудняет процедуру очистки; ни одна из рестриктаз не обладает свойствами термостабильности; низкий выход фермента Ecal, который составляет 1000 единиц активности на 4 гр сырой биомассы.

Известен термофильный штамм Bacillus stearothermophilus [2]. Это штамм, способный продуцировать эндонуклеазы рестрикции BstEI, BstEII, BstEIII (сайт узнавания для BstEII-5'-GGTNACC-3'). Основным недостатком штамма является наличие 3 эндонуклеаз рестрикции, что значительно усложняет стадии выделения и очистки ферментов. Культуральные и биотехнологические свойства штамма не опубликованы.

Наиболее близким к заявляемому штамму является штамм Bacillus stearothermophilus, продуцирующий единственную рестриктазу BstPI [3, прототип]. Для культивирования этого штамма требуется дорогостоящая питательная среда: сердечно - мозговая вытяжка - 37 г/л. Температура культивирования - 55^oC, выращивание ведется при интенсивной аэрации до поздней log-фазы. При этом выход биомассы не превышает 2,2 г/л. Выход эндонуклеазы рестрикции составляет 1125 ед/г сырой биомассы. Недостатком данного штамма является невысокий выход рестриктазы.

Технической задачей изобретения является получение штамма, продуцирующего единственную рестриктазу, узнающую и расщепляющую нуклеотидную последовательность 5'-GGTNACC-3' с высоким выходом фермента.

Поставленная задача решается выявлением и использованием штамма Bacillus stearothermophilus - продуцента сайт-специфической рестриктазы BstT10I.

Предлагаемый штамм выделен из почвы в результате поиска термофильных продуцентов рестриктаз.

Полученный штамм Bacillus stearothermophilus депонирован в НИИ ККМ Государственного Научного Центра вирусологии и биотехнологии "Вектор" под регистрационным номером B-684, а продуцируемая им рестриктаза названа BstT10I согласно общепринятой номенклатуре.

Штамм Bacillus stearothermophilus характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки. Клетки палочковидные, прямые, 0,6-1,0 • 2,0-3,5 мкм, подвижные, спорообразующие. Споры овальные, превышают диаметр клетки. Расположение спор, как правило, терминальное или субтерминальное. На плотной среде образуют полупрозрачные колонии неправильных очертаний, блестящие. Консистенция колоний пастообразная, легко берется петлей.

Культуральные признаки. Штамм нетребователен к факторам роста, хорошо растет на обычных питательных средах (СПА, МПА, МПБ). Оптимальная температура роста 55^oC, pH 7,0-7,2. Культуру поддерживают пересевом на плотных средах, хранят в растворе глицерина при -70^oC или в лиофильно-высушенном состоянии.

Физиологические признаки. Слабо гидролизует крахмал, каталазоположителен. Растет при концентрации NaCl до 2% и при температуре от 40^o до 65^oC. Не наблюдается роста в анаэробном агаре, реакция Фогес - Проскауэра отрицательная. Образует кислоту из глюкозы, но не газ, не утилизирует тирозин, не восстанавливает нитраты.

Для культивирования Bacillus stearothermophilus B-684 применяют среду следующего состава (г/л): рыбный гидролизат - 37, вода дистиллированная - остальное. Культивирование проводят при 55^oC и интенсивной аэрации до достижения фазы замедления роста. Выход целевого фермента 4,000 ед/г сырой биомассы с удельной активностью 10,000 ед/мл.

Определяющим отличием предлагаемого штамма от штамма-прототипа является высокая продуктивность штамма, превышающая по данному показателю штамм-прототип.

Поскольку предлагаемый штамм получен впервые и для выделения рестриктазы, имеющей сайт узнавания 5'-GGTNACC-3', никогда не использовался, можно сделать вывод о соответствии предлагаемого штамма критериям изобретения "новизна" и "изобретательский уровень".

На чертеже представлена электрофореграмма продуктов гидролиза ДНК фага лямбда ферментом BstT10I (дор.1), BstT10I и BstEII (сайт узнавания 5'-GGTNACC-3') (дор.2), BstEII (дор.3).

Как видно из представленного чертежа, идентичность полос расщепления при параллельном и совместном гидролизе подтверждает их изошизомерию.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения.

Пример 1. Получение биомассы и выделение фермента.

Перед началом работы клетки штамма-продуцента пересевают бактериологической петлей на агаризованную среду. Чашки Петри помещают в термостат на 55^oC. После 10 ч инкубации подросшие клетки пересевают в колбы со свежей питательной средой, состоящей из (г/л): рыбный гидролизат - 37, вода дистиллированная - остальное.

Культивирование проводят при 55^oC с аэрацией 1,5 объема/мин, при перемешивании - 150 об/мин, до фазы замедления роста. Клетки собирают центрифугированием при 1500 g и температуре 4^oC. Дезинтеграцию, выделение и очистку проводят по методике Bickle, Pirotta, Imber [4].

Пример 2. Определение специфичности и активности фермента.

Специфичность фермента определяют по картине параллельного и совместного гидролиза субстратной ДНК (чертеж). Идентичность картин гидролиза на 1-3 дорожках говорит о том, что эти ферменты узнают и расщепляют одинаковую последовательность нуклеотидов 5'-GGTNACC-3'.

Выход фермента определяют по электрофоретической картине гидролиза ДНК фага лямбда. За единицу активности принимают минимальное количество фермента, необходимое для полного расщепления 1 мкг ДНК фага лямбда в течение 1 ч при температуре 55^oC. Выход фермента составляет 4,000 ед/г сырой биомассы, удельная активность 10,000 ед/мл.

Фермент хранится при -20^oC в глицерине.

Таким образом, получен штамм, обладающий более высокой продуктивностью по сравнению со штаммом-прототипом.

Поскольку рестриктаза BstT10I имеет сайт узнавания 5'-GGTNACC-3', идентичный сайту узнавания рестриктазы BstPI, она может заменить прототип во всех генноинженерных работах.

Штамм Bacillus strearothermophilus-продуцент рестриктазы Bst T101, предназначен для изучения специфичности белокнуклеиновых взаимодействий. Выделен из почвы в результате поиска продуцентов рестриктаз, обеспечивающий получение рестриктазы, узнающей и расщепляющей нуклеотидную последовательность 5' - GGTN ACC-3'. Выход фермента составляет 4,000 ед/г сырой биомассы, удельная активность целевого фермента составляет 10,000 ед/мл. Рестриктаза Bst T101 является изошизомером рестриктазы и может заменить последнюю во всех генноинженерных работах. 1 ил.

Штамм бактерии Bacillus stearothermophilus НИИ ККМ В-684 - продуцент эндонуклеазы рестрикции, узнающей и расщепляющей последовательность нуклеотидов 5'-GGTNACC-3'.