Способ получения биомассы SтRертомYсеS, обогащенной эндонуклеазой рестрикции SFI I. Советский патент 1991 года по МПК C12N9/14 

Изобретение относится к микробиологии и касается способов получения биомассы бактерий Streptomyces fimbriatus с высоким содержанием рестриктазы Sfi I.

Эндонуклеазы рестрикции являются важными инструментами генетической инженерии. Рестриктаза Sfi I, выделенная из Streptomyces fimbriatus S-750, является уникальным ферментом, способным узнавать и расщеплять октануклеотидную палиндром- ную последовательность j варьируемым участком вставки 5 -GGCCN4N GGCC-3 .

Способы получения рестриктаз различаются между собой используемыми штаммами, условиями культивирования, стадиями очистки Оптимизация каждой

стадии позволяет увеличить выход целевого продукта, однако решающего значения можно достигнуть, целенаправленно влияя на биосинтез рестриктазы, изменяя условия культивирования.

В литературе сведений о получении биомассы Streptomyces fimbriatus. обогащенной эндонуклеазой рестрикции Sfi I, не обнаружено.

Известен способ получения биомассы микроорганизмов вида Streptomyces achromogenes ATCC12767, включающий в себя культивирование в колбах на среде следующего состава, г/л: глюкоза 10,0 пептон 4,0; дрожжевой экстракт 4,0, MgSO 7НгО 0,5; К2НР04 4,0. КН2Р04 2 0 (среда S)

х| О

S

ел

на круговых качалках(200об/мин) при 30°С, рН среды 7,0-7,1; культивирование продолжали 24 ч. Выход биомассы 6,65 г/л.

Недостатком способа является сложный состав питательной среды, низкий выход биомассы и невозможность, используя штамм, получить эндонуклеазу рестрикции Sfi I.

Наиболее близким к предлагаемому является способ получения биомассы из Streptomyces grisens, включающий культивирование продуцента на питательной среде S при температуре 30° С в колбах в течение 15 ч при перемешивании. Клетки центрифугировали и хранили при 20°С, Выход биомассы составляет 8,2 г/л культураль- ной жидкости. Выход рестриктазы Sgr I 20 ед/г мицелия.

Основными недостатками прототипа являются: невысокий выход биомассы; низкий выход целевого фермента; многокомпонентная сложная питательная среда; невозможность данным способом получить фермент, узнающий и расщепляющий последовательность нуклеотидов 5 -GGCCN5- GGCC-3 .

Целью изобретения является повышение выхода биомассы и увеличение выхода целевого продукта.

Поставленная цель достигается тем, что инокулят продуцента фермента, содержащий 8-10 колоний микроорганизмов на 1 л среды, подвергают гомогенизации перед культивированием, а культивирование биомассы Streptomyces fimbriatus ведут на питательной среде, содержащей гидролизат кильки в количестве 3,5-3,7%, в течение 48- 53 ч при перемешивании, которое в течение первых двух суток осуществляют со скоростью 200-220 об/мин, а начиная со вторых суток - 150 об/мин.

Способ заключается в следующем.

Колонии микроорганизма Streptomyces fimbriatus (ВКПМ S-750), выросшие на твердой питательной среде, переносят (из расчета 8-10 колоний на 1 л жидкой питательной среды) в стеклянный гомогенизатор. Колонии тщательно ресуспендируют до образования гомогенной массы, после чего переносят в жидкую питательную среду, состоящую из 3,5-,7% гидролизата кильки.

Культивирование ведут на термостатированных качалках при 30°С в течение 48-53 ч при перемешивании, при этом в течение первых суток (24 ч) перемешивание осуществляют со скоростью 200-220 об/мин, а начиная со вторых суток (с 25 ч) - со скоростью 150 об/мин.

После 53 ч купьтивирования клетки центрифугируют и выделяют из биомассы рестриктазу Sfi I известным способом (табл 1) Выход биомассы составляет 18-20 г/л культуральнойг жидкости. Выход рестриктазы Sfi I составляет 1000 ед. акт./г. Удельная

активность рестриктазы Sfi I составляет 3000 ед/мл.

Получаемая рестриктаза Sfi I узнает и расщепляет последовательность нуклеотидов 5 -GGCCN4 -GGCC-31, свободна от неспе0 цифического нуклеазного загрязнения и пригодна для использования в генноинже- нерных работах.

Определяющими отличительными признаками способа являются следующие.

51. Инокулят продуцента фермента, содержащий 8-10 колоний микроорганизмов на 1 л питательной среды, подвергают гомогенизации, что позволяет повысить выход биомассы.

0Особенностью Streptomyces fimbriatus

является то, что колонии этого микроорганизма представляют собой сферические образования в форме шариков. Поэтому небходимо перед высевом в жидкую питэ5 тельную среду провести тщательную их гомогенизацию, что дает возможность получать гомогенную биомассу, состоящую из колоний размером 1.5 20мм с высоким выходом.

0В случае отсутствия предварительной

гомогенизации биомасса представляет собой крупные клеточные конгломераты диаметром 5-8 мм и единичные мелкие колонии диаметром до 1,0 мм, что затрудняет выде5 ление фермента.

Зависимость выхода и качества биомассы от дозы посевного материала и режима обработки представлена в табл.2.

Из табл.2 видно, что оптимальным режи0 мом для получения биомассы Streptomyces fimbriatus является использование посевной дозы колоний субстратного мицелия на 1 л свежей питательной среды и последующая гомогенизация инокулята

5При использовании посевной дозы менее 8 колоний на 1 л выход биомассы падает а при использовании более 10 колоний на 1 л дальнейшее повышение выхода не происходит, однако наблюдается неравномерное

0 разрушение биомассы.

2. Культивирование продуцента ведут на питательной среде, содержащей 3,5- 3,7% гидролизата кильки в качестве органического источника аминного азота и

5 незаменимых аминокислот, что позволяет повысить выход биомассы и целевого фермента.

В табл.3 представлена зависимость выхода биомассы и фермента от состава питательной среды.

Из табл.3 видно,что использование гид- ролизата кильки в экспериментально подобранной оптимальной концентрации (3,5-3,7%) способствует максимальному накоплению рестриктазной активности, за счет чего повышается выход целевого фермента.

- При использовании питательной среды с запредельными значениями концентраций гидролизата кильки (меньше 3,5 и боль- ше 3,7%) выход биомассы и фермента снижается.

3. Культивирование продуцента ведут в течение 48-53 ч при перемешивании, при этом в течение первых суток (24 ч) переме- шивание осуществляют со скоростью 200- 220 об/мин, а начиная со вторых суток (с 25 ч) - со скоростью 50 об/мин, что позволяет повысить выход биомасы и целевого фермента.

В табл.4-5 приведены зависимости выхода биомассы и фермента от времени культивирования и скорости перемешивания гомогенной биомассы.

Из табл.4 и 5 видно, что увеличениеуро- жая клеток в первой фазе культивирова- ния(24 ч) происходит при перемешивании со скоростью 200-220 об/мин, что связано с эффективным разрушением клеточных ассоциаций, а уменьшение скорости переме- шивания до 150 об/мин во второй фазе роста(после 24 ч)способствует увеличению гомогенной биомассы, обогащенной ре- стриктазой.

На чертеже представлены электрофо- реграммы продуктов гидролиза линеаризованной по Vsp I - сайту плазмиды pDKR 85 ферментом Sfi I, где:

1дорожка -ДНКрОКР85

2дорожка - обработка ферментом 15 мин

3дорожка - 30 мин

4дорожка - - - 45 мин

5дорожка - - - 1ч

Как видномз чертежа при культивирова- нии бактерии Streptomyces fimbriatus предлагаемым , способом получают рестриктазу Sfi I, специфически гидролизу- ющую субстрат, не имеющую побочных интерферирующих активностей.

П р и м е р 1. Клетки выращивают на твердой питательной среде (СПА). 9 колоний стерильно помещают в стеклянный гомогенизатор и тщательно ресуспендируют, однородную суспензию добавляют в 1 л питательной среды, состоящей из 3,6% гидролизата кильки. Культивирование ведут на термостатированных качалках при 30СС с перемешиванием 210 об/мин в течение 24 ч, далее 150 об/мин. После 50 ч культивирования клетки центрифугируют. Выход биомассы 20 г/л. Биомассу хранят при -70°С.

20 г клеток суспендируют в 80 мл буфера А (0.01М калий-фосфатный буфер, pHG 7,5 М / -меркаптоэтанол, ЭДТА, 10 М фенилметилосульфонилфторид) и разрушают на ультразвуковом дезинтеграторе. Обломки клеток удаляют центрифугированием (18000 об/мин. 30 мин при 4°С) и надосадочную жидкость наносят на 250 мл ДЕАК-сефарозы 6В (Pharmacia), уравновешенной буфером А, затем колонку промывают буфером А до ичезновения УФ-поглощающего материалал в элюате.

Несвязавшийся с колонкой белок высаливали добавлением сульфата аммония до 70% насыщения и собирали центрифугированием (10000 об/мин. 20 мин при4°С). Осадок растворяли в 20 мл буфера А, содержащего 0,15М NaCI,диализовали против буфера А, содержащего 0.15М NaCI в течение 16 ч и наносили на 50 мл гепарин- сефарозы (Pharmacia). Колонку промывали буфером А, содержащим 0.15М NaCI до исчезновения УФ-поглощающего материала в элюате, затем буфером А, содержащим 0.14 М NaCI vi 0,01 % tween 20 (Serva). до исчезновения УФ-поглощающего материала в элюате. затем фермент элюировали буфером А, содержащим 1 М NaCI. Белок в смыве высаливали добавлением сульфата аммония л 70% насыщения и собирали центрифугированием (10000 об/мин, 20 мин при 4°С) Осадок белка растворяли в 5 мл буфера А. содержащего 0.15М NaCI, диализовали против буфера А. содержащего 0.15М NaCI, в течение 16 ч. наносили на 15 мл гепарин-сефарозы. уравновешенной буфером А, содержащим 0.15М NaCI, и элюировали 150 мл градиентом 0,5-1.5 М NaCI в буфере А. Обьем каждой фракции 5 мл. Аликвоты из каждой фракции (1 мкл) инкубировали 1 ч при 50° С с 1 мкг ДНК фага Т7 и анализировали в геле агарозы. Реакции, расщепляющие ДНК фага Т7 (21-29), объединяли, диализировали 3 ч против 2 л буфера А, содержащего 0.15М Nad, наносили на 20 мл НТР - biogel (BioRad) и элюировали 400 мл градиентом (буфер А, содержащий 0.15М NaCI. буфер А. содержащий 0,5М калий-фосфат и 0,15М NaCI). Объем фракций 10 мл. Фракции, содержащие Sfi I, определяли так же, как при хроматографии на гепарин-сефарозе.Фракции 29-32 объединяли и диализовали против буфера, содержащего 0,01М трис-HCI, рН 7,5, 0,2М KCI, 0,1мМ ЭДТА, 1мМ дитиот- рептол, 50% глицерин.

За единицу активности принимали минимальное количество фермента, необходимое для полного расщепления 1 мкг ДНК плазмиды pDKR85 в течение 1 ч при БО°С.

Ферментный препарат хранят при -20°С. ,

Из 1 г биомассы получают 1000 ед. рестрикта- Зы Sfi I с удельной активностью 3000 ед/мл.

П р и м е р 2. Подготовку инокулята и Культивирование ведут аналогично примеру 1, кроме того, что берут 10 колоний на 1 л реды, состоящей из 3,7% гидролизата киль- л. Перемешивание осуществляют при 220 | б/мин в течение первых 24 ч, далее 150 об/мин. Клетки собирают после 53 ч. Выход биомассы 20 г/л. Выход фермента составляет 1000 ед/г, удельная активность 3000 ед/мл.

П р и м е р 3, Подготовку инокулята и культивирование ведут так же, как в примере 1, кроме того, что берут 8 колоний на 1 л свежей питательной среды на основе 3,5% гидролизата кильки. Перемешивание в пер- ной фазе осуществляют со скоростью 200 об/мин. Клетки собирают после 48 ч Выход биомассы 18 г/л. Выход фермента 1000 д/г, активность 3000 ед/мл.

Формула изобретения Способ получения биомассы Streptomyces, обогащенной эндонуклеа- зой рестрикции Sfi I, включающий подготовку инокулята, культивирование продуцента фермента на жидкой питательной среде, содержащей органический источник азота, углерода, минеральные соли и воду при 30°С с перемешиванием и последующим отделением биомассы от культу- ральной жидкости, отличающийся тем что, с целью повышения выхода биомассы и увеличения выхода целевого фермента, в качестве микроорганизмов берут штамм

Streptomyces fimbriatus ВКПМ , используют инокулят, содержащий 8-10 колоний микроорганизмов на 1 л среды, который перед культивированием подвергают гомогенизации, культивирование продуцента ведут на питательной среде, содержащей в качестве источника азота, углерода и минеральных солей гидролизат кильки в количестве 3,5-3,7%. в течение 48-53 ч при перемешивании, осуществляемом в течение

первых суток со скоростью 200-220 об/мин а начиная с вторых суток - 150 об/мин

Изобретение относится к области микробиологии и касается способов получения биомассы бактерий Streptomyces fimbnatus с высоким содержанием рестриктазы Sfi I, и увеличение выхода целевого фермента. Способ заключается в следующем. Колонии микроорганизма Streptomyces fimbriatus (ВКПМ S 750), выросшие на твердой питательной среде, гомогенизируют и переносят в жидкую питательную среду, состоящую из 3.5-3,7% гидролизата кильки. Выход биома- сы составляет 18-20 г/л культуральной жидкости, выход рестриктазы Sfi I 1000 ед/г 5 табл . 1 ил. (Л С

Примечание, Активность объединенной фракции до диализа против

50% глицерина. Удельная активность целевого продукта составляет 3°000 ед/мл или 60 „000 ед/мг

Т а б л и ц а 1

Сердечно-мозговая вытяжка12

(Difco)

L-среда (триптон (Difco) 10 г

Дрожжевой экстракт (Difco) 5 г 15 Nad10 г

0,1% KN03, 0,05% К2НР04.,

0,05% Nad, 0,OOU FeS04-7H20

0,002% СаСрз, 0,05% MgSO, ,

2% глюкоза, 0,01% аланин,

10 мг/мл n-аминобензойная кислота,

0,02% дрожжевой экстракт,

0,05% гидролизат

кильки,

%

s-среда

Таблица2

Не тестируется

Не тестируется

10

Не тестируется

утстг крупи мелколо

800 1000 900 200

Фоновая активность

Таблица

100 150 ЙО 150 150 150

200

160

220

220

Таблица5

Не тестируется 8

1680 18 90 20 100 12 60

Некондиционная биомасса

1751

. Много мелких клоний наряду с 2,0 мм

18АО Некондиционная биомасса