Штамм бактерий BacILLUS вRеVIS - продуцент рестриктазы В @ 12 I Советский патент 1991 года по МПК C12N9/14 C12N1/20 

довательность нуклеотидов б - G(A/T) GC(A/T)C3 .

Наиболее близким к предлагаемому является штамм - продуцент рестриктазы Hgi А 1, узнающей и расщепляющей последовательность 5 G(A/T)GC(A/T)C-3 . Штамм выращивают на среде, содержащей 1% бактоказитон (Difco), 0,5%-ный дрожжевой экстракт. Культивирование осуществляют в термостатированных качалках при 30°С.

Недостатками данного штамма (по литературным данным) являются низкий выход фермента, составляющий 3000 ед/г сырой биомассы, а также требовательность к богатым и дорогостоящим питательным средам (выход биомассы не указан).

Цель изобретения - выявление штамма Bacillus brevis - продуцента, синтезирующего рестриктазу Bbv 12 I, способную узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов 5 G(A/T)GC(A/T)C-3 с более высоким выходом фермента.

Штамм выделен из бурой окультуренной почвы в результате систематического поиска штаммов - продуцентов эндонукле- аз рестрикции в роде Bacillus и хранится в ВКПМ под регистрационным номером В- 4906.

Рестриктаза из Bacillus brevis B-4906 названа 12 I согласно общепринятой номенклатуре.

Штамм Bacillus brevis характеризуется следующими признаками.

Культу рал ьно-морфо логические признаки. На МПА и РА колонии кремовые, пло- ские, гладкие, блестящие. Клетки палочковидные, размеры: длины 1.6 - 2,5 и ширина 0,6 - 0,8 мкм. Образуют эндоспоры овальной формы, расположенные в основном центрально или парацентрально. Отмечается некоторое раздувание спорангия. Аэробы, температурный оптимум роста 27 - 30°С, растет при РН 7,0 - 9,0.

Физиолого-биохимические свойства. Образует каталазу, протеазу, крахмал не гидролизует, ацетоинотрицательные, нитраты не восстанавливает, в 7%-ном NaCI не растет, кислоту из глюкозы, арабинозы, ксилозы, маннита не образует, утилизирует цитрат. Из источников азота использует пептон и соли аммония.

Предлагаемый штамм в отличие от известного хорошо растет в агаризованной пи- тательной среде отечественного производства, приготовленной на основе 3,7% гидролизата кильки.

Биомасса легко лизируется лизоцином.

Хранение штамма осуществляют под вазелиновым маслом или в 30%-ном глицерине при 70°С.

Для глубиного культивирования Bacillus brevis B-4906 применяют питательную среду следующего состава, г/л:

Рыбный гидролизат 37 Вода Остальное

Культивирование проводят при 30°С с хорошей аэрацией до достижения фазы замедления роста. Выход рестриктазы Bbv 12 I 6000 ед/r сырой биомассы. 0 Определяющие отличия предлагаемого штамма Bacillus brevis следующие:

штамм содержит одну сайт-специфическую рестриктазу Bbv 12 I способную узнавать и расщеплять нуклеотидную 5 последовательность 5 -G(A/T)GC(A/T)C-31:

продуктивность штамма в 2 раза превосходит по целевому ферменту известный штамм.

Предлагаемый штамм способен к куль- 0 тивированию в недорогой питательной среде отечественного производства.

Пример. Культуру хранят в косяках под вазелиновым маслом. Перед началом работы клетки пересевают бактериологиче- 5 ской петлей на твердую агаризованную среду (3,7% СПА)./

Чашки Петри помещают в термостат на 30°С.

После 24-часовой инкубации подрос- 0 шие клетки пересевают в колбы со свежей питательной средой, состоящей из 3,7% гидролизата кильки, и помещают в термостат на ночь. Ночную культуру штамма Bacillus brevis засевают в жидкую пита- 5 тельную среду, состоящую из 3,7% рыбного гидролизата, остальное - вода. Культивируют в термостатированных качалках при температуре 30°С при 200 об/мин до достижения фазы замедления роста. Клетки 0 осаждают центрифугированием при 4°С. Выделение осуществляют по известной методике Bickle, Pirotta Imber. Выход фермента составляет 6000 ед/г сырой биомассы. Фермент хранится при 20°С в глицерине. 5 Полученный штамм обладает следующим преимуществами по сравнению с известным:

содержит сайт-специфическую рестриктазу Bbv12 I с высоким выходом фермента 0 (6000 ед/г вместо 3000 ед/г у известного.

Способен расти на простых недорогих отечественных средах.

Поскольку рестриктаза Bbv 12 I имеет

сайт узнавания, идентичный сайту узнава5 ния Hgl A I, а выход фермента более высок,

то Bbv12 I может заменить известный во

всех генно-инженерных работах.

Формула изобретения

Штамм бактерий Bacillus brevis ВКПМ В-4906- продуцент рестриктазы Bbv12 I.

Изобретение относится к биотехнологии и генной инженерии. Цель изобретения - выявление штамма Bacillus brevis, синтезирующего рестриктазу Bbv 12 I, способную узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов 5 - G(A/T) GC (А/Т)С - 3 с более высоким выходом фермента. Предлагаемый штамм выделен в результате систематического поиска штаммов - продуцентов рестриктаз и хра- нитсячво ВКПМ ВНИИгенетика под регистрационным номером В-4906. Штамм продуцирует рестриктазу Bbv 12 I, имеющую сайт узнавания, идентичный рестрик- тазе Hgl A I, и может полностью заменить известный во всех генно-инженерных работах. Преимуществом предлагаемого штамма является повышение выхода целевого фермента, вдвое большего чем у известного штамма. Выход фермента Bbv 12 (составляет 6000ед./гсырой биомассы. Штамм неприхотлив к питательным средам. для определения молекулярных весов фрагментов ДНК. Данная рестриктаза является удобной моделью для излучения специфичности белок-нуклеиновых взаимодействий. Известен штамм Bacillus brevis - продуцент рестриктазы Bbv II, Однако культивирование штамма трудоемко, выход рестриктазы составляет 667 ед/r сырой биомассы. Кроме того, рестриктаза, продуцируемая этим штаммом, не способна узнавать и расщеплять послеЁ О ю Јь о &