Штамм бактерий BacILLUS SрнаеRIсUS-продуцент рестриктазы BSI 1 Советский патент 1992 года по МПК C12N9/14 C12N1/20 

последовательности узнавания рестриктазы Bsl I.

Наиболее близким к изобретению по специфичности продуцируемой рестрикта- зы является штамм Xanthomonas holclcola, продуцирующий рестриктазу Xho I, узнающую последовательность 51 -CTCGAG-31 , 3 -GAGCTC-5 которая однако на 1 /6 отличаете от последовательности узнавания рестриктазы Bsl I.

Таким образ ом, к настоящему времени все известные рестриктазы отличаются по последовательностям узнавания от рестриктазы Bsl I. Заявляемый штамм является продуцентом рестриктазы с неизвестной ранее специфичностью.

Цель изобретения - получение штамма, продуцирующего рестриктазу, узнающую и расщепляющую последовательность нукле- отидов 51 -CTCGTG-31 .

Предлагаемый штамм выделен в результате поиска продуцентов рестриктаз из пресноводной микрофлоры.

Штамм Bacillus sphaerlcus 2B-3 депонирован во Всесоюзной коллекции промыш- ленныхмикроорганизмов ВНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов (г. Москва) под номером ВКПМ В-5446.

Штамм Bacillus sphaerlcus 2B-3 имеет следующие характеристики.

Морфологические признаки. В молодой культуре (16-18 ч) клетки подвижные, палочковидные, 0,6 мкм в поперечнике и 1,5-3 мкм в длину. Располагаются поодиночке, иногда короткими цепочками. Грамположи- тельные. Клетка способна образовывать сферическую спору, расположенную терминально и раздувающую спорангий.

Физиолого-биохимические признаки. Штамм - строгий аэроб. Каталазоположи- тельный. Не образует кислоту, газ и ацетоин из глюкозы. Кислоту не образует также из арзбинозы, сорбита, рамнозы, сахарозы, мальтозы, лактозы, глицерина, маннита, этанола. Гидролизует желатин, но не крах- мал и твин-80. Не восстанавливает нитрат в нитрит. Не образует сероводород и индол. В аэробных условиях растет на среде из гидролизата кильки при температуре от 4 до 40°С (оптимум 37°С), концентрации NaCI от О до 3% (оптимум 0,7%), рН от 6 до 8 (оптимум рН 7). Содержание G+C в ДНК 4Т% (по плавучей плотности).

Культуральные признаки. Среда 1, питательный агар, г/л: панкреатический гид- ролизат кильки 17.9; NaCI 5,9;.агар 11,2, рН 7,3 + 0,1, После 18 ч инкубирования при 37°С образует крупные круглые приплюснутые гладкие блестящие сероватые колонии. Среду используют для оживления культуры.

Среда 2, питательный бульон, г/л: гидроли- зат кильки 33; NaCI 7, рН 7,3 + 0,1. Среду используют для препаративного выращивания клеток. При встряхивании при 37оС культура дает равномерную муть, сгустков не образует.

Штамм Bacillus sphaerlcus 2B-3 - продуцент рестриктазы Bsl I, узнающей и расщепляющейпоследовательностьнуклеотидов 51 -CTCGTG-31 З1 -GAGCAC-51 в составе двухцепочечной ДНК, выделен и охарактеризован впервые.

На чертеже изображена электрофорег- рамма разделения в 1 %-ном агарозном геле продуктов расщепления ДНК фага Аре- стриктазами Ava II + исходная А ДНК (дорожка 1) и Bsl I (дорожка 2). Длины фрагментов маркерной ДНК даны в парах оснований.

П г и м е р 1. Культивирование штамма Bacillus sphaerlcus 2B-3 и выделение рестриктазы Bsl I. Культуру высевают на среду 1 в чашке Петри и инкубируют 17ч при37°С. Отдельную колонию переносят в 200 мл среды 2 л L выращивают при 37°С. Полученную культуру используют для засева 4 л среды 2 в ферментере фирмы LKB (Швеция). Выращивание проводят при 30°С. с аэрацией 4 л/мин, при скорости вращения мешалки 200 об/мин. В конце логарифмической фазы роста (через 6 ч) клетки осаждают центрифугированием и хранят при -20°С. Урожай клеток 4 г/л. Рестриктазу выделяют по традицион- ной схеме, включающей разрушение клеток ультразвуком, гель-фильтрацию экстракта на биогеле А 0,5 М с последующей хроматог- рафической очисткой фермента на ДЗАЭ- целлюлозе и фосфоцеллюлозе. Препарат хранят в буфере с 50%-ным глицерином. Выход рестриктазы 500 ед/г биомассы.

П р и м е р 2. Определение активности рестриктазы Bsi I. Фермент инкубируют 60 мин при 37°С в 30 мкл реакционной смеси, содержащей 20 мМ трис-HCI, рН 8,0; 20 мМ NaCI; 10 мМ MgCte; 2 мкг ДНК фага А. Затем проводят электрофорез смеси в геле 1 %-ной агарозы. За единицу активности принимают количество фермента, достаточное для полного специфического расщепления 1 мкг ДНК фага А в этих условиях.

Примерз. Определение последовательности нуклеотидов, узнаваемой ре- стриктазой Bsl I. Специфичность Bsl t определяют сравнением экспериментально полученных длин рестриктов ДНК фага А с теоретически рассчитанными из первичной структуры ДНК. Длины фрагментов после гидролиза ДНК фага А рестриктазой Bsl I

определяют по электрофоретической подвижности относительно маркерных фрагментов (чертеж). При помощи ЭВМ рассчитывают длины фрагментов для всевозможных сайтов узнавания и сравнивают их с экспериментальными данными. Их совпадение (таблица) доказывает, что рестрик- таза Bsi I узнает последовательность 5 -CTCGTG-31 S -GAGCAC-S1 в составе ДНК. Для подтверждения полученных данных проводят гидролиз ДНК плазмиды pBR322 рестриктазой Bsi I. Фермент расщепляет

эту ДНК в положениях: 2655, 4030 и 4340

}

что также соответствует положению сайта 5 -CTCGTG-31 3 -GAGCAC-5 в составе нуклео- тидной последовательности ДНК pBR322.

10

15

Экспериментальные и теоретические длины фрагментов ДНК фага Я (в парах оснований) получены при расщеплении ДНК эн- донуклеазой рестрикции Bsi I и рассчитаны для сайта 51 -CTCGTG-31 31 -GAGCAC-51 .

Таким образом, преимущество полученного штамма по сравнению с известными состоит в том, что для специфического расщепления ДНК по последовательности 5 - CTCGTG-3 3 -GAGCAC-5 пригодна только рестриктаза Bsi I заявляемого штамма.

Формула изобретения Штамм бактерий Bacillus sphaerlcus

ВКПМ В-5446 - продуцент рестриктазы

BSI1.

/ г

Использование: биотехнология и генная инженерия. Сущность изобретения: штамм выделен из пресноводной микрофлоры и хранится в ВКПМ ВНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов под номером ВКПМ В-5446. Штамм продуцирует эндонуклеазу рестрикции Bsl I, которая является новым ферментом среди известных рестриктаЗ. Bsl I расщепляет последовательность 51 - CTCGNG - З1 3 -GAGCAC-5( в составе двухцепсГчечной ДНК. Биомассу штамма выращивают при аэрации в питательном бульоне на основе гидролизата кильки до поздней логарифмической фазы. Клетки разрушают ультразвуком й выделяют рестрикта- зу путем гель-фильтрации на биогеле А 0,5М с последующей хроматографйческой очисткой фермента на ДЭАЭ-целлюлозе и фосфо- целлюлозе. Выход фермента 500 ед/г биомассы. Препарат пригоден для генно-инженерных работ. 1 ил., 1 табл. узнает последовательность 51 -CTGGAG-31, , которая подобно З1 -GACCTC-51 последовательности узнавания Bsf 1 является частично палиндройн ой и совпадает с последней на 4/6. Однако рестриктаза Gsu I не может заменить Bsi I в силу различий их последовательностей узнавания. Известен штамм Anabaena variabllis. продуцирующий рестриктазу Ava I. Ava I узнает последовательность 51 -CTCGAG-31 , которая однако отличается от З1 -G(C)GCGC-5 ё VJ 00 N О Ьь кэ

Ш02 BI26

6555МЧ2/

3676

2606

2555

213Ь

2005

95Г