.1
(21)4361460/28-13
(22)11.01.88
(46) 30.10.89 Бюл. № 40
(71)Научно-исследовательский кон- структорско-технологический институт биологически активных веществ и Тихоокеанский институт биоорганической химии Дальневосточного отделения
АН СССР
(72)С.Х. Дегтярев, В.Е, Репин, Н.И. Речкунова, Л.С, Певченко, Е.П. Иванова и В.А. Рассказов
(53)577.15(088.8)
(56) Catalog Biolabs, 1986/1987, Calleja F. de Marsac N.T,, Cowisin T. van Ormondt H. de Waard A. Nucl. Acid, Res, 1985, 13,18,
6745-675 .
Timko I. Horwits A., Zelinka I,
Wilcox G.-I. Bacteriol., 1981, 145,
873-877.
(54)DJTAMM БАКТЕРИЙ Bacillus species 21 - ПРОДУЦЕНТ САЙТ-СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ЭН- ДОНУКЛЕАЗЫ Bse 21 I
Изобретение относится к микробиологической промьпиленности и генной инженерии н касается получения нового штамма, продуцирующего сайт- специфическую эндонуклеазу, способную узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов 5 -CCTNGG-3 .
Цель изобретения - выявление штамма-продуцента Bacillus species 21 (ВКПМ В-3672), селективно продуцирующего с высоким выходом сайт-спе(57) Изобретение относитя к микробиологической промьшшенности и генной инженерии. Цель изобретения - выявление штамма-продуцента Bacillus species ВКПМ В-3672, селективно продуцирующего с высоким выходом сайт- специфическую эндонуклеазу рестрикции, способную узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов CCTNAGG-З . Штамм выделен в результате поиска штаммов-продуцентов рест- риктаз из морской воды бухты Золотой Рог Петра Великого Японского моря. Предлагаемьй штамм нетребователен к питательным средам, легко разрушается ультразвуком, обеспечивает повы- выход целевого фермента, составляющий ЗОООр ед/г биомассы. Штамм Bacillus species В-3672 продуцирует сайт-специфическую эндонуклеазу Bse 211, имеет сайт узнавания 5- CCTNAGG-3 , идентичный сайту узнавания рестриктазы Sau Т, и может полностью заменить известный во всех генно-инженерных работах.
цифическую эндонуклеазу рестрикции, способную узнавать и расщеплять по- следовательность нуклеодитов 5 CCTNGG-3 . I
Предлагаемый штамм выделен в результате поиска штаммов-продуцентов рестриктаз из морской воды бухты Золотой Рог залива Петра Великого Японского моря, продуцируемая им рестриктаза названа Bse 21 согласно
(Л
ел
00
оо ю
общепринятой номенклатуре Натана и Смита,
111тамм Bacillus species 21 характеризуется следующими признаками о
Морфологические признаки.
Клетки палочковидные, прямые, 0,6 1,0 и 1,5-2,5 мкм (иногда до 5 мкм), подвижные о Образуют эндоспоры овальной формы (не более одной в спорангии Расположение спор преимущественно центральное, без отчетливой раздутости спорангии, Околоспоральных тел не обнаружено. Споры термоустойчивы Отмечается грамвариабельнссть„
Культуральные признаки.
Хорошо растут на обычных питательных средах (СПА, МПБ), нетребовательны к факторам роста,На агаризованных средах образуют круглые, плоские колонии беловатого цвета. Края ровные При росте в ферментерах пО14утнение равномерное. Оптимальная температура роста 30°С.
Культуру поддерживают пересевом на агаризованных чашках Петри. Хорош хранится под вазелиновым маслом, в растворе глицерина - при -70 С и в лиофильно высушенном состоянии.
Физиологические признаки,
Хемоорганотроф, Каталазоположи- телЬный, оксидазоотрицательный. Утилизирует лактозу, сахарозу, мальтозу арабинозу, глюкозу, галактозу, ман- нит. Не утилизирует раннозу, ксилозу дульцит сорбит. Реакция Фогео-Проска уэра отрицательная. Разжижает желатину и крахмал.
Для культивирования Bacillus species 21 В-3672 применяют питательную среду следующего состава, г/л дистиллированной воды:
Гидролизат
кильки40,0
NaCl27,0
Вода дистиллированнаяОстальное
Культивирование проводят при и интенсивной аэрации до достижения стационарной фазы роста.
Выход биомассы: 2,0-3,0 г сырой биомассы с 1 л питательной среды.
Выход целевого фермента: 3000 ед/ биомассы с удельной активностью 20000 ед/нп.
Штамм выращивают в питательной среде следующего состава, г/л: гидро- лизат кильки 40; NaCl 27; остальное вода. Культивирование выполняют при
5
0
0
5
0
5
0
5
интеисииной аэрации (2 об./мин), перемеи ивании (150 об,/мин) при до конца фазы замедления роста (5 ч), Клетки собирают центрифугированием при lOOOg и температуре 4 С, Выход биомассы составляет 2,2 г/л, Биомассу весом 2,2 г суспендируют в 20 мл 0,02 С трис-НС буфера, рН 7,5, содержащего 10 М меркапэтанола и 0,1% тритона Х-100, и разрушают на ультразвуковом диспергаторе. Обломки клеток удаляют центрифугированием (12000g, 30 мин) и надосадочную жидкость наносят на колонну с биогелем А 0,5 М (Bio Rad) объемом 600 мл, уравновешенную 0,02 М г-талийфосфатным буфером, содержащим меркапэтанола, 5 ЭДТА, 0,8 М NaCl и 0,1% тритона Х-100 (буфер А). Фермент злю- ируют и тем же буфером со скоростью 20 мл/ч о Фракции объемом 10 мл собирают и анализируют на присутствие активного фермента. Фракции, содержащие максимальную рестриктазную активность, объединяют и диализуют против 2 л 0,02 М калийфосфатного буфера, рН 7,5, содержащего 10 М меркапзта- нола и 5-КГ м ЭДТА (буфер В), трижды меняя буфер. Диализат наносят на колонку с ДЕАЕ-цаллюлозой объемом 20 мл (ДЕ-52 VThatman), уравновешенную буфером В, Колонку проглшают буфером В до исчезновения УФ-поглощаю- щего материала в элюате. Фгрмент не сорбируется на ДЕАЕ-целлюлоэе.
Раствор фермента наносят на колон-- ку с фосфоцеллюлозой (Р-11, Uliatman) объемом 5 мл, уравновешеннук; буфером В, и промывают колонку тем же 5у- (Ьером, Элюирование фермента проводят (100 мл) градиентом NaCl JOT 0,0 до 1,0 М в буфере Bt Объем каждой фракции 5 мл. Фракции 8-10, содержащие рестриктазу, объединяют и диализуют против буфера В, содержащего 0,1 М NaCl и 50%-ный глицерин.
За единицу активности принимают минимальное количество фермента, необходимое для полного расщепления мкг ДНК фага в течение 1 ч при . Ферментный препарат хранится в глицерине при - , Выход фермента 30000 ед/1 г биомассы бактерий, уд, активность 20000 ед/нл.
Полученный штамм по сравнению с известным обеспечивает повышенньй выход целевого фермента, составляющий 30000 ед/г биомассы (в 30 раз
51518372,6
больше, чем известный штамм); не тре-она может заменить известную во всех
бует длительного культивирования,генно-И1шенерных работах,
легко разрушается ультразвуком Формула изобретения Поскольку рестриктаза Bie 21 имеет , Штамм бактерий Bacillus species 21
сайт узнавания 5 -CCTNAGG-3 , иден-ВКПМ В-3672 - продуцент сайт-специфитичный сайту узнав ания рестриктазы,ческой эндонуклеазы Bse 21 I.
Изобретение относится к микробиологической промышленности и генной инженерии. Целью изобретения является выявление штамма-продуцента BACILLUS SPECIES ВКПМ В-3672, селективно продуцирующего с высоким выходом сайт-специфическую эндонуклеазу рестрикции, способную узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов 5Ъ-CCTNAGG-3Ъ. штамм выделен в результате поиска штаммов-продуцентов рестриктаз из морской воды бухты Золотой Рог залива Петра Великого Японского моря. Предлагаемый штамм нетребователен к питательным средам, легко разрушается ультразвуком, обеспечивает повышенный выход целевого фермента, составляющий 30000 ед/г биомассы. Штамм BACILLUS SPECIES В-3672 продуцирует сайт-специфическую эндонуклеазу BSE 21 1, имеет сайт узнавания 5Ъ-CCTNAGG-3Ъ, идентичный сайту узнавания рестриктазы SAU 1, и может полностью заменить известный во всех генно-инженерных работах.
