Способ получения ферментных мембран Советский патент 1990 года по МПК C12N11/08 C12N11/00 

20%-ным раствором едкого натра при 50°С, Пористость получаемых при этом ядерных фильтров зависит от времени травления (табл.1). Она составляет 0,02-3%. Для приготовления ферментного слоя 1600 ед. глюкозооксидаэы растворяют в 0,6 мл 0,01 М фосфатного буфера рН 6,8, добавляют О, мл Ц, Умного сывороточного альбумина и 0, мл 25%-ного глутарового альдегида. Эту смесь тщательно перемешивают и выливают на ядерные фильтры размерами 20x20 см. На поверхность приготовленных двухслойных мембран надевают ацетатцеллюлозную мембрану толщиной 10 мкм. Полученные трехслойные мембраны помещают в холодильник на 2k ч. Затем разрезают на куски диаметром 2 мм и накладывают на Pt электрод (с Pt электродом контактирует ацетатцеллюлозная мембрана) и определяют ток электрода при рН 7,2 и 19°С, задавая 0,6 В отн. Ag/AgCl электрода.

Зависимость чувствительности электрода и диапазона линейного участка калибровочных графиков от пористости мембраны приведена в табл, 1.

Аналогично примеру 1 готоаг тэех- слойную мембрану с использс-Ct- Ur макропористой .чи по изь° . fij viy

СПОСОбу (ПОРИСТОСТЬ i,). to,

линейного участка градуировок ior о грасрь.сз при использовании 3

раНЫ СОСТ ЭЬЛЯС 1,5 ММ, О l /BCTBi lтельность - 21,6 нА/мМ.

Пример 2. Аналогично примеру 1 изготавливают ферментную мембрану для определения этанола с использова- нием алкогольоксидазы. Для сравнения параллельно используют макропористую мембрану по прототипу.

В табл. 2 приведены сравнительные

лактатоксидазы растворяют L капле смеси сывороточного альбумина и глутарового альдегида в пропорциях как в примере 1 и выливают на ядерный фильтр, определяют ток электрода при рН 7,2.

Линейная зависимость градуировоч- ного графика при испопьзовании ядерного фильтра наблюдается до концентрации лактата 10 мМ, в том время как в случае использования макропористой мембраны она сохраняете ч только до концентрации 1,5 мМ. Диапазон измеряемых концентраций расширяется в 6 раз.

Пример k. Срав игельное определение глюкозы в крсчи с использованием фермеитно. мембране, изготовленной по предложенному и известному способам.

Готовят фермеч-ч ю мембоану аналогично примепу , наносят ее на электрод, измеряют ток нанесении на электрод кап--и неразбавленной крови. Параллельно изготавливают ферментную мембрану по известному способу, иэмеряют -к электродI в 20-кратно .еннсм , зце ис- спегуемой i рс при помощи анализа- то з ЗКСАН-Г) ,

Устамовленн ie концентрации глюкозы приведены в табл. 3.

Как видно из табл. 3, найденные концентрации практически совпадают.

Данные, приведенные в табл. 1 показывают, что при использовании ядерных фильтров, пористость которых 0,02-3%, обеспечивается достижение цели, так как диапазон линейности градуировочных графиков расширяется в 2-50 раз, т.е. концентрация определяемой глюкозы в растворе может составлять -100 мМ, вместо 1,9 мМ.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способам получения ферментных мембран, которые могут найти применение в измерительных приборах на основе ферментных электродов для определения метаболитов, физиологически важных соединений и ферментной активности. Цель изобретения - улучшение качества целевого продукта за счет расширения диапазона измеряемых концентраций субстратов ферментов. Способ получения ферментных мембран заключается в связывании ферментов с нерастворимым пленочным носителем в присутствии глутарового альдегида и сывороточного альбумина. В качестве носителя используют микропористые ядерные фильтры с пористостью 0,02 - 3,0%, приготовленные из лавсановой пленки путем ее облучения в ускорителе ионами инертных газов с последующим травлением в растворе щелочи. Способ позволяет получить ферментные мембраны, пригодные для измерения концентраций субстратов ферментов в диапазоне их концентраций 4 - 10 мМ, тогда как известные мембраны пригодны только до концентрации 1,5 - 2 мМ. 3 табл.

параметры полученных электродов.

Из этих данных следуе, что линейность градуировочных графиков в случае использования ядерных фильтров наблюдается до 30 мМ в случае электрода 2, до 15 мМ (3), до 7,5 мМ И) и до 5 мМ (5), тогда как градуировоч- ный график электрода, содержащего мембрану (1), изготовленную согласно известному способу, нелинеен уме при концентрации 2,5 мМ.

Пример 3. Аналогично примеру 1 изготавливают ферментную мембрану для определения лактата. Для приготовления ферментного слоя 50 ед.

5 Наибольший диапазон линейности граду- ировочного графика наблюдается при использовании ядерного фильтра с пористостью 0,02%, однако при этом чувствительность электрода уменьшается до 0,05 нА/мМ. Аналогичная вза- имосвязь между диапазоном линейности и чувствительностью следует также из макрокинетического уравнения. Таким образом, оптимальными параметрами с практической точки зрения обладают мембраны, в которых используются ядерные фильтры с пористостью 0,05-3%. Они обладают линейностью в практически важном диапазоне концентрации глю51

козы и достаточной чувствительностью,

Механическая прочность ядерных фильтров до травления составляет 12,6-13,4 кг/мм2 и уменьшается до 9,3 кг/мм при травлении в течение 30 мин при 50 С и в 20%-ном растворе щелочи. Таким образом, прочность предложенной мембраны с низкой пористостью бопьше, чем макропористой мембраны по известному, прочность которой меняется в пределах 7,5- 9,1 кг/мма при изменении пористости от 4,7 до 11 ,4%.

Таким образом, применение предложенного способа поззоляет улучшить кг естео целевого продукта за счет расширений диапазона измерг.еммх концентрации Ферментов в

Диапазон линейного участка калибровочного графика, мМ УуҐсГГр йТё л s г ь , чд/м 1

100

50 35

25

20

15 Ю

j J.ob 0,19 0,35 1,0 1,65 2,5 5 12,5 20

Примечание,

Этанолчувствительные электроды исследованы при рН 8, содержат макропористую мембрану (1) или микропористые ядерные фильтры (2-5); время траеления 10 мин (2), 15 мин (3), 20 мин (4) и 30 мин (5).

50ТаблицаЗ

358926

2-50 раз (ог 4 до 100 мМ вместо 1,9 мМ).

Формула изобретения

D

Способ получения ферментных мембран, включающий связывание ферментов с лавсановой мембраной путем обработ10 ки глутаровым альдегидом в присутствии сывороточного альбумина, отличающийся тем, что, с целью улучшения качества целевого продукта за счет расширения диапазона измеряец- мых- концентраций субстратов ферментов, в качестве лавсановой мембраны используют ядерные фильтры с пористостью 0,02-3,0%, полученные из лавсановой пленки.

Таблица 1

25

20

15 Ю