ФРАГМЕНТ КОМПЛЕМЕНТАРНОЙ ДНК ВИРУСА ЖЕЛТУХИ САХАРНОЙ СВЕКЛЫ, КОДИРУЮЩИЙ ГЕН КАПСИДНОГО БЕЛКА Российский патент 1994 года по МПК C12N15/40 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генетической инженерии, представляет собой фрагмент комплементарной ДНК вируса желтухи сахарной свеклы (ВЖС), кодирующий ген капсидного белка, и может быть использовано для защиты растений.

Вирусные желтухи сахарной свеклы наносят существенный урон урожаю. В зависимости от вируса и срока заражения потери урожая корнеплодов колеблются от 40 до 60%, а выхода сахара - от 50 до 80%. Вирус желтухи сахарной свеклы (ВЖС) - наиболее вредоносный из комплекса вирусов, вызывающих желтухи (Watson et al., 1953; Smith & Hinckes, 1987).

Из-за особенностей биологии ВЖС агротехнические мероприятия дают эффект при защите сахарной свеклы от ВЖС лишь ценой значительных затрат на постоянный мониторинг и обработки инсектицидами (Smith & Hinckes, 1987). По экологическим соображениям внесение пестицидов желательно ограничить до минимума, что вступает в противоречие с требованиями защиты растений. Наиболее экологически перспективными являются биологические методы защиты растений.

Несмотря на отмеченную корреляцию между содержанием вируса в растении и потерей урожая, считается, что целью защиты растений является не снижение концентрации вируса или его полное исчезновение, а борьба с симптомами вирусного заболевания (Beachy et al., 1990).

В настоящее время перспективны три направления биологической защиты растений (Beachy et al., 1990).

1. Безвирусное растениеводство, основанное на культуре меристемной ткани, свободной от вируса.

2 Поиск природного гена устойчивости и перенос его в геном культурных растений.

3. Введение в геном растения генов или фрагментов генома фитовирусов.

Безвирусное растениеводство, несмотря на ряд достоинств, неприменимо к культуре сахарной свеклы.

Второе направление не получило применения в защите сахарной свеклы, поскольку поиск и выделение природных генов устойчивости пока не увенчался успехом.

В настоящее время применение получило третье направление - введение в геном растения генов или фрагментов генома фитовирусов. Наиболее перспективным, в том числе и для сахарной свеклы, считается введение в геном растения ДНК, включающей ген капсидного белка соответствующего вируса в конструкциях, обеспечивающих синтез белка оболочки в трансгенных растениях (Beachy et. al., 1990; Powell et al., 1990). Чтобы создать такую конструкцию, необходимо определить первичную структуру гена белка оболочки. Особенностью этого типа защиты является строгая специфичность против данного вируса, а часто даже против конкретного штамма вируса.

Прототипом данного изобретения можно рассматривать ген капсидного белка вируса слабого пожелтения сахарной свеклы (ВСПС) (Veidt et al., 1988), одного из комплекса вирусов, вызывающих желтухи.

Недостатком прототипа можно считать то, что это ген капсидного белка лишь одного (ВСПС) из нескольких вирусов, вызывающих желтухи и не может обеспечить устойчивость растений к ВЖС. Первичная структура гена капсидного белка ВЖС ранее была неизвестна.

Целью изобретения является получение гена капсидного белка вируса желтухи сахарной свеклы для конструирования в дальнейшем трансгенных растений, устойчивых к вирусу.

Изобретение представляет собой ген капсидного белка ВЖС, нуклеотидная последовательность которого определена методом Сэнгера с помощью дидезоксинуклеотидных терминирующих аналогов по комплементарной ДНК, синтезированной на вирусспецифической РНК с использованием обратной транскриптазы. Последовательность состоит из 688 нуклеотидных остатков; она содержит 5'-некодирующую область с точкой старта мРНК для капсидного белка и область, кодирующую капсидный белок из 203 аминокислотных остатков, не считая N-концевого метионина, удаляемого посттрансляционно. Идентичность капсидного белка и кодируемого данной последовательностью белкового продукта установлена иммунопреципитацией продукта трансляции данного гена антисывороткой к ВЖС.

П р и м е р. В качестве исходного материала для получения кДНК-клонов используется РНК ВЖС, выделенная из очищенного препарата вируса и фракционированная в градиенте концентрации сахарозы как описано ранее (Karasev et al. , 1989). 20 мкг очищенной РНК ВЖС отжигается с 0,2 о.е. синтетического праймера IV, 5' d(CAAGGCTCGAGAAGTTTCACC)3', в 20 мМ Трис-HCl буфере pH 7,5 с 0,1 М NaCl, 1 мМ ЭДТА при 56^оС в течение 1,5 ч. Синтез первой цепи проводится обратной транскриптазой вируса птичьего миелобластоза (Омутнинск); синтез второй цепи - ДНК-полимеразой 1 и РНКазой н по методу (Gubler, 1988). Двуцепочечные кДНК разделяют электрофорезом в 0,8% легкоплавкой агарозе, вырезают фракцию размером более 1,5 т.п.н., элюируют ее из геля и лигируют в плазмиду pTZ19, разрезанную рестриктазой Smal. После трансформации компетентных клеток E.coli XL-1 рекомбинантные клоны, содержащие вирусспецифическую вставку отбирают гибридизацией in situ. В качестве зонда при этом используют кДНК, синтезированную на матрице РНК ВЖС обратной транскриптазой вируса птичьего миелобластоза с использованием праймера IV, меченного полинуклеотидкиназой фага Т4 в реакции с γ -[³²P]АТФ. Из 200 клонов был отобран 1 (клон х19), содержавший вставку размером 1,8 т.п.н., имевший вблизи 1 из концов сайт узнавания рестриктазы Хhol и дававший сильный гибридизационный сигнал. Данный вирусспецифический фрагмент имел 1 внутренний BamHI, 1 внутренний Xho1 и 3 внутренних EcoRI-сайта. Были получены 3 субклона: х19(Bam-Xho1) и х19(Есо2-Xho1) фрагменты, лигированные в pTZ19, и х19(Хho1-Bam), лигированный в pTZ18. После трансформации и отбора клонов были синтезированы соответствующие им одноцепочные ДНК-матрицы, которые были использованы в секвенирующих реакциях с использованием набора Sequenase^TM (Pharmacia) и α -[³²P]АТФ. Продукты реакции разделяли в 6% полиакриламидном геле в присутствии 7 М мочевины при 55^оС и авторадиографировали в течение ночи. Чтение последовательности проводили визуально. Последовательность из 688 нуклеотидов содержала 1 открытую рамку трансляции, способную кодировать белок с мол. массой 22,2 кДа. Размер этого белка и его аминокислотный состав полностью совпали с размером и аминокислотным составом капсидного белка ВЖС, установленными ранее (Carpenter et al., 1977). Для окончательной идентификации капсидного белка ВЖС двуцепочечная ДНК субклона pTZ18-x19(Xho1-Bam) линеаризовалась рестриктазой Pstl и использовалась для транскрипции in vitro РНК-полимеразой фага Т7, и полученный транскрипт транслировали в бесклеточной системе из ретикулоцитов кролика. Продукты трансляции синтетического транскрипта анализировали до и после иммунопреципитации сывороткой к ВЖС в полиакриламидном геле ка описано ранее (Rarasev et al. , 1989) Транскрипт клона pTZ18-x19(Xhо1-Bam) направляет синтез одного продукта, не содержащего метионина, который положительно реагирует с сывороткой к ВЖС.

Таким образом, получен ген капсидного белка ВЖС, включая кодирующую область (615 нуклеотидов) и примыкающую к ней 5' некодирующую область (73 нуклеотида), который может быть использован для получения трансгенных растений, устойчивых к ВЖС. Ниже приведена нуклеотидная последовательность гена капсидного белка ВЖС и аминокислотная последовательность самого капсидного белка (СР) ею кодируемого.

TAACACAGTTACTAAGGTTCCATTTTAT
10 20
-> (CP)
M G S A E TACAGTATTGTTTTTGTTTTAGCGTAATCGTACTTGAGTTTCGTTATGGGATCAGCTGAA 30 40 50 60 70 80 P I S A I A T F E N V S L A D Q T C L H CCTATTAGTGCAATCGCGACTTTTGAAAACGTAAGTCTCGCAGACCAAACCTGTTTGCAC 90 100 110 120 130 140 G E D C D K L R K N F E E C L K L K G V GGAGAAGACTGCGATAAACTTAGGAAGAACTTCGAAGAGTGTTTGAAATTAAAAGGGGTT 150 160 170 180 190 200 P E D N L G I A L G L C L Y S C A T I G CCGGAAGATAACCTCGGAATCGCGTTAGGACTTTGTTTGTATTCCTGTGCTACGATAGGC 210 220 230 240 250 260 T S N K V N V Q P T S T F I K A S F G G ACTTCCAACAAAGTTAACGTCCAACCGACGTCTACCTTCATCAAAGCTTCGTTTGGTGGT 270 280 290 300 310 320 G K E L Y L T H G E L N S F L G S Q K L GGGAAGGAACTGTACCTCACTCACGGTGAATTGAATTCCTTTCTGGGGTCTCAAAAACTT 330 340 350 360 370 380 L E G K P N K L R C F C R T F Q K D Y I TTGGAGGGAAAACCTAACAAATTGCGGTGTTTCTGCCGTACTTTTCAGAAGGACTACATA 390 400 410 420 430 440 S L R K E Y R G K L P P I A R A N R H G TCCTTGCGCAAGGAATACCGAGGGAAATTACCTCCGATTGCCAGAGCTAACCGTCACGGT 450 460 470 480 490 500 L P A E D H Y L A A D F I S T S T E L T CTACCCGCTGAAGATCACTACTTAGCCGCTGACTTCATATCGACGTCGACGGAACTCACT 510 520 530 540 550 560 D L Q Q S R L L L A R E N A T H T E F S GACCTACAACAAAGTCGTCTGCTGTTAGCGCGCGAAAACGCCACTCACACGGAATTCTCG 570 580 590 600 610 620 S E S P V T S L K Q L G R G L G T G R * TCTGAATCACCGGTAACCAGTTTGAAACAACTAGGTCGTGGTCTAGGCACCGGGAGATGA 630 640 650 660 670 680

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генетической инженерии. Сущность изобретения: получен ген капсидного белка вируса желтухи сахарной свеклы, который может быть использован для конструирования трансгенных растений, устойчивых к вирусу. Определена нуклеотидная последовательность из 688 нуклеотидных остатков, она содержит 5′ - некодирующую область с точкой старта мРНК для капсидного белка и открытую рамку трансляции, кодирующую капсидный белок из 203 аминокислотных остатков, не считая N-концевого метионина, удаляемого посттрансляционно.

ФРАГМЕНТ КОМПЛЕМЕНТАРНОЙ ДНК ВИРУСА ЖЕЛТУХИ САХАРНОЙ СВЕКЛЫ, КОДИРУЮЩИЙ ГЕН КАПСИДНОГО БЕЛКА, полученный в реакции обратной транскрипции вирусспецифической РНК, содержащий 688 нуклеотидов, из них 73 нуклеотида в 5¹-некодирующей области и 615 нуклеотидов в открытой рамке трансляции, кодирующих капсидный белок вируса желтухи сахарной свеклы из 204 аминокислотных остатков, и имеющий следующую последовательность:
TAACACAGTTACTAAGGTTCCATTT
10 20
MGSAE
TATTACAGTATTGTTTTTGTTTTAG
30 40 50
PISAIAT
CGTAATCGTACTTGAGTTTCGTTAT
60 70
FENVSLADQ
GGGATCAGCTGAACCTATTAGTGCA
80 90 100
TCLHGEDC
ATCGCGACTTTTGAAAACGTAAGTC
110 120
DKLRKNFE
TCGCAGACCAAACCTGTTTGCACGG
130 140 150
ECLKLKGVP
AGAAGACTGCGATAAACTTAGGAAG
160 170
EDNLGIAL
AACTTCGAAGAGTGTTTGAAATTAA
180 190 200
GLCLYSCA
AAGGGGTTCCGGAAGATAACCTCGG
210 220
TIGTSNKVN
AATCGCGTTAGGACTTTGTTTGTAT
230 240 250
VQPTSTFI
TCCTGTGCTACGATAGGCACTTCCA
260 270
KASFGGGK
ACAAAGTTAACGTCCAACCGACGTC
280 290 300
ELYLTHGEL
TACCTTCATCAAAGCTTCGTTTGGT
310 320
NSFLGSQK
GGTGGGAAGGAACTGTACCTCACTC
330 340 350
LLEGKPNK
ACGGTGAATTGAATTCCTTTCTGGG
360 370
LRCFCRTFQ
GTCTCAAAAACTTTTGGAGGGAAAA
380 390 400
KDYISLRK
CCTAACAAATTGCGGTGTTTCTGCC
410 420
EYRGKLPP
GTACTTTTCAGAAGGACTACATATC
430 440 450
IARANRHGL
CTTGCGCAAGGAATACCGAGGGAAA
460 470
PAEDHYLA
TTACCTCCGATTGCCAGAGCTAACC
480 490 500
ADFISTST
GTCACGGTCTACCCGCTGAAGATCA
510 520
ELTDLQQSR
CTACTTAGCCGCTGACTTCATATCG
530 540 550
LLLARENA
ACGTCGACGGAACTCACTGACCTAC
560 570
THTEFSSE
AACAAAGTCGTCTGCTGTTAGCGCG
580 590 600
SPVTSLKQL
CGAAAACGCCACTCACACGGAATTC
610 620
GRGLGTGR
TCGTCTGAATCACCGGTAACCAGTT
630 640 650
*
TGAAACAACTAGGTCGTGGTCTAGG
660 670
CACCGGGAGATGA
680 .