СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ ПИЩЕВЫХ ТОКСИКОИНФЕКЦИЙ Российский патент 1994 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунохимической диагностике афлатоксикоза в структуре недиагностируемых пищевых токсикоинфекций.

Известен клинический способ дифференциальной диагностики пищевых токсикоинфекций, который должен быть подтвержден бактериологическими и серологическими методами исследования.

Клиническая диагностика типична и субъективна, бактериологические методы не столь эффективны, серологические методы не всегда можно использовать из-за практического отсутствия стандартных антигенов. Поэтому примерно 30% пищевых токсикоинфекций, энтероколитов остаются нерасшифрованными, а диагноз афлатоксикоз практически не выставляется.

Афлатоксин В₁ (АТ В₁) - вторичный метаболит микроскопических плесневых грибов рода Aspergillus, развивающихся на пищевых продуктах при неправильном их хранении (при высокой температуре и влажности). Употребление продуктов питания, загрязненных АТ В₁ вызывает заболевание афлатоксикоз, для которого характерно нарушение деятельности желудочно-кишечного тракта, поражение печени, почек, центральной нервной системы. Кроме того, АТ В₁ обладает мутагенным, тератогенным, канцерогенным, ангиопаралитическим действием, поэтому загрязнение им пищевых продуктов представляет значительный гигиенический риск для человека. До настоящего времени нет надежных способов обезвреживания продуктов питания, загрязненных АТ В₁.

Согласно современным представлениям защита организма от неблагоприятных воздействий обеспечивается формированием иммунитета не только к высокомолекулярным субстратам (молекулы, клетки, ткани), но и к низкомолекулярным соединениям. Низкомолекулярные вещества могут трансформироваться в печени в высокореакционно-способные соединения, которые легко соединяются с альбуминами печени. Известно, что АТ В₁ трансформируется в эпоксид, который вступает в соединение с альбуминами с образованием конъюгата АТ В₁-альбумин, обладающего антигенными свойствами. Наличие специфических антител и сенсибилизированных клеток рассматривается как свидетельство сенсибили- зации организма АТ В₁ с последующим развитием афлатоксикоза. Практически на сегодняшний день нет методов диагностики афлатоксикоза.

Цель изобретения - дифференциация афлатоксикоза в структуре нерасшифрованных токсических отравлений.

Сущность способа состоит в том, что кровь больного смешивают с конъюгированным антигеном на основе афлатоксина В₁, инкубируют, далее по известной методике определяют выход калия в надосадочной жидкости, и при показателе повреждения лейкоцитов по калию (ППЛ-К), равном и более 50% устанавливают афлатоксикоз.

В качестве антигена впервые использован конъюгированный афлатоксин В₁ в дозе 0,4 мг/мл, полученный в лаборатории микотоксикологии Кыргызского научно-исследовательского института профилактики и медицинской экологии Минздрава Республики Кыргызстан.

Способ осуществляется следующим образом. В центрифужную пробирку помещают 0,02 мл конъюгированного АТ В₁, разведенного 5%-ным цитратом натрия. Для контроля в другую пробирку наливают 0,02 мл цитрата натрия. В обе пробирки добавляют 0,08 мл крови больного, взятой микропипеткой из пальца, смесь тщательно перемешивают и инкубируют 2 ч в термостате при 37^оС, встряхивают пробы через час. Затем в каждую пробирку добавляют по 0,9 мл изотонического раствора хлористого натрия, содержимое перемешивают, центрифугируют 10 мин при 1500 об/мин, и 0,5 мл надосадочной жидкости отсасывают во флакон, где содержится 1,5 мл дистиллированной воды. В жидкости с помощью пламенного фотометра определяют содержание калия. Диагностический коэффициент (ДК) рассчитывают по формуле
ДК = · 100 % , где О - содержание калия в опытной пробе;
К - содержание калия в контрольной пробе.

Для клинического исследования были привлечены больные (62 человека) с диагнозом: пищевая токсикоинфекция. Данные лица были разделены на 2 подгруппы: А - с подозрением на афлатоксикоз (22 человека). Это больные, связывающие свое заболевание с употреблением продуктов, пораженных плесневыми грибами, либо продуктов, которые могли содержать афлатоксин. Клинически заболевание протекало с дисфункцией кишечника, сопровождалось болями в животе, жидким стулом, интоксикацией, отсутствием температуры.

Б - больные с расшифрованной этиологией пищевого отравления.

Кроме этого способ испытан на модели экспериментального афлатоксикоза у кроликов и у лиц, имеющих постоянный контакт с АТ В₁ (исследователи, работающие в лаборатории микотоксикологии).

Контролем служили здоровые доноры.

Результаты исследования на афлатоксикоз приведены в табл.1.

Из таблицы видно, что ППЛ - К у больных с подозрением на афлатоксикоз достоверно превышает аналогичный показатель по сравнению с другими группами (р < 0,001). Поэтому повышение ППЛ - К у больных с этиологически нерасшифрованной дисфункцией кишечника в реакции со специфическим антигеном может служить диагностическим признаком афлатоксикоза.

Исследователи, работающие с АТ В₁, имеют выраженную сенсибилизацию к конъюгированному АТ В₁ (р < 0,001) по сравнению с контролем, но значительно низкий уровень ППЛ - К по сравнению с группой больных с подозрением на афлатоксикоз (р < 0,001). Эти лица отмечают периодические дисфункции кишечника при обычной диете. Наличие повышенной сенсибилизации клеток крови к афлатоксину остается у них в клинически компенсированной форме.

Афлатоксикоз в эксперименте вызывали на кроликах. С этой целью кроликам перорально вводили АТ В₁ в дозе 0,4 мг на 1 кг веса 10 раз с интервалом в 2 дня. До затравки (фон) и после нее определяли ППЛ - К в динамике на 6, 10, 15, 20, 30-й дни. Параллельно проводили клинические наблюдения за животными, регистрировали летальность.

Результаты представлены в табл.2.

При расчете доверительных интервалов при р ≅0,05 за диагностическую границу были взяты величины ППЛ - К≥50%.

П р и м е р 1. Больная Р., 38 лет, работает кассиром в столовой. Диагноз: пищевая токсикоинфекция. Заболевание связывала с употреблением в пищу старого сыра с запахом плесени. У больной на 5-й день заболевания была взята кровь из пальца. 0,08 мл крови смешали с 0,02 мл конъюгированного афлатоксина В₁ на 5%-ном растворе лимоннокислого натрия (опыт). Такое же количество крови смешивали с цитратом натрия без антигена (контроль). Пробирки 2 ч инкубировали в термостате при 37^оС, затем добавляли в них по 0,9 мл физиологического раствора. Далее пробирки центрифугировали 10 мин при 1500 об/мин, отсасывали 0,5 мл надосадочной жидкости и смешивали с 1,5 мл дистиллированной воды. Затем в пробах определяли содержание калия на пламенном фотометре в соответствии с инструкцией к прибору.

Результаты: опытная проба - 29, контрольная проба - 16. Показатель повреждения лейкоцитов по калию
ППЛ - К = · 100 % = 81.3 %
Диагноз: афлатоксикоз.

П р и м е р 2. Больная Г., 22 лет, работает на фабрике, отравилась в столовой. Клинически заболевание сопровождалось жидким стулом, слабостью, кратковременной рвотой, тошнотой, ознобом, повышением температуры. Кровь больной исследовали описанным способом.

Результаты: опытная проба - 44,5, контрольная проба - 34,5
ППЛ - К = · 100 % = 29 %
Диагноз: пищевая токсикоинфекция подтвержденной сальмонеллезной этилогии.

П р и м е р 3. Исследователь К. 35 лет, работающий с АТ В₁ в течение 5 лет. Кровь, взятую из пальца, исследовали приведенным способом.

Результаты: опытная проба - 10, контрольная проба - 7
ППЛ - К = · 100 % = 42.8 %
Диагноз: клинически здорова. Однако периодически отмечает кратковременное расстройство желудочно-кишечного тракта.

П р и м е р 4. Здоровый донор, 26 лет. Из пальца взята кровь 0,08 мл и смешана с 0,02 мл конъюгированного АТ В₁ на 5%-ном растворе цитрата натрия. Такое же количество крови смешали с 0,02 мл цитрата натрия без антигена. В дальнейшем реакцию выполняли по описанной методике.

Результаты: опытная проба - 11,5, контрольная проба - 9,5
ППЛ - К = · 100 % = 21 %
Таким образом, способ позволяет впервые в клинике провести дифференциальный диагноз афлатоксикоза, улучшить расшифровку пищевых токсикоинфекций и предложить новый диагностический показатель афлатоксикоза, ранее не известный в практике. К тому же впервые использован новый конъюгированный антиген (3) и отработан с ним в клинике лаборатоpный способ дифференциальной диагностики афлатоксикоза.

Из примеров, таблиц и при расчете доверительного интервала при р≅0,05 видно, что при показателе равном и более 50% пищевая токсикоинфекция вызвана афлатоксинами. Показатели менее 50% характерны для пищевых токсикоинфекций другой этиологии (сальмонеллезной, стафилококковой). Пpедложенный способ позволяет пpовести этиологическую pасшифpовку не только пищевых токсикоинфекций, но и гепатитов, токсических поpажений почек и т.д., дать лабоpатоpный высокоспецифичный, эффективный метод для пpактического здpавоохpанения, котоpый позволяет в 94 случаев поставить диагноз - афлатоксикоз.

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунохимической диагностике афлатоксикоза в структуре недиагностируемых пищевых токсикоинфекций. Цель - уточнение диагностики афлатоксикоза. Кровь больного смешивают с конъюгированным антигеном, полученным на основе афлатоксина B₁, инкубируют и далее определяют выход калия в надосадочной жидкости при повреждении лейкоцитов (ППЛ) и при показателе ППЛ - К равным и более 50% устанавливают афлатоксикоз. 2 табл.

СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ ПИЩЕВЫХ ТОКСИКОИНФЕКЦИЙ путем исследования крови, отличающийся тем, что , с целью уточнения пищевого отравления афлатоксином, исследуемую кровь смешивают с коньюгированным антигеном афлатоксина В, инкубируют и определяют показатель выхода калия в надосадочной жидкости при повреждении лейкоцитов и при показателе, равном и более 50%, диагностируют афлатоксикоз.